三種方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌-乙胺丁醇藥物敏感性試驗(yàn)的比較

孫慶 趙麗麗 陳燕 趙秀芹 吳移謀 萬(wàn)康林

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·論著·

三種方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌-乙胺丁醇藥物敏感性試驗(yàn)的比較

孫慶 趙麗麗 陳燕 趙秀芹 吳移謀 萬(wàn)康林

目的 比較3種以細(xì)菌培養(yǎng)為基礎(chǔ)的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)乙胺丁醇的藥物敏感性。方法 采用改良羅氏培養(yǎng)基比例法(L-J法)、 Bactec MGIT 960檢測(cè)系統(tǒng)法(960法)和微孔板Alamar blue顯色法[最低抑菌濃度法(MIC法)]同步對(duì)126株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行乙胺丁醇藥敏試驗(yàn)，比較分析3種方法的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析處理。Kappa值在0.4～0.75為一致性較好，Kappa值≥0.75為一致性極佳，Kappa值<0.4為一致性差。結(jié)果 3種方法總體一致率為75.4%(95/126)。若以L(fǎng)-J法測(cè)定結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，則960法和MIC法的敏感度、特異度和一致率分別為62.8%(49/78)、100.0%(48/48)、77.0%(97/126)和82.1%(64/78)、97.9%(47/48)、88.1%(111/126)，MIC法與L-J法一致性極佳(Kappa=0.76)，而960法與L-J法比較顯示一致性較好(Kappa=0.56)。若以960法測(cè)定結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，則L-J法和MIC法的敏感度、特異度和一致率分別為100.0%(49/49)、62.3%(48/77)、77.0%(97/126)和98.0%(48/49)、77.9%(60/77)、85.7%(108/126)，L-J法和MIC法均顯示與960法有較好一致性(Kappa≥0.70)。若以MIC法測(cè)定耐藥結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，則L-J法和960法的敏感度、特異度和一致率分別為98.5%(64/65)、77.0%(47/61)、88.1%(111/126)和73.8%(48/65)、98.4%(60/61)、85.7%(108/126)。3種方法的不一致性主要表現(xiàn)在MIC值4.0～16.0 μg/ml的藥物濃度范圍。結(jié)論 3種方法對(duì)乙胺丁醇進(jìn)行藥敏試驗(yàn)具有較好的一致性，但也存在一定差異。L-J法和960法均與MIC法具有較高一致性，且MIC法性?xún)r(jià)比更高，適于耐乙胺丁醇結(jié)核病的早期診斷。

結(jié)核分枝桿菌； 乙胺丁醇； 微生物敏感性試驗(yàn)

近年來(lái)，全球耐藥結(jié)核病的發(fā)病率呈上升態(tài)勢(shì)[1-2]，已嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的身體健康，結(jié)核分枝桿菌的耐藥問(wèn)題也成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。耐藥結(jié)核病主要是由于濫用抗生素和不規(guī)范治療引起[3-4]；因此，合理的臨床治療對(duì)于控制耐藥結(jié)核病極為重要，快速、準(zhǔn)確的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)是制定合理有效的個(gè)體化抗結(jié)核化療方案的關(guān)鍵。目前，主要的結(jié)核病藥敏試驗(yàn)有常被用作診斷耐藥金標(biāo)準(zhǔn)的羅氏培養(yǎng)基比例法(L-J法)，快速診斷耐藥結(jié)核病的 Bactec MGIT 960檢測(cè)系統(tǒng)法(簡(jiǎn)稱(chēng)“960法”)及快速、經(jīng)濟(jì)的微孔板Alamar blue顯色法[最低抑菌濃度法(MIC法)]，等等[5-6]。這些藥敏試驗(yàn)方法在現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)室均有應(yīng)用，然而大量的文獻(xiàn)表明其檢測(cè)結(jié)果存在一定的差異，其中對(duì)乙胺丁醇(EMB)的符合率最低[7-10]。因此，筆者分別比較了L-J法、960法及MIC法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)于乙胺丁醇的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，并探討其符合率低的緣由。

材料和方法

一、菌株來(lái)源及試劑

1.菌株來(lái)源： 126株結(jié)核分枝桿菌臨床株及質(zhì)控菌株H37Rv由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室傳代保存。

2.主要試劑：① EMB藥物純品，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。② L-J法用改良羅氏培養(yǎng)基，按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》(下簡(jiǎn)稱(chēng)《規(guī)程》)配制[11]。③ Bactec MGIT 960 培養(yǎng)管及添加劑均由美國(guó)BD公司生產(chǎn)。④ Middlebrook 7H9培養(yǎng)基干粉、Middlebrook OADC(油酸、白蛋白、右旋糖和過(guò)氧化氫酶)購(gòu)自美國(guó)BD公司。⑤ 阿爾瑪藍(lán)(Alamar blue)染料購(gòu)自英國(guó)AbD Serotec公司，現(xiàn)配現(xiàn)用。⑥ McFarland標(biāo)準(zhǔn)比濁管由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所結(jié)核室提供。

3. 主要儀器設(shè)備：① 培養(yǎng)基蒸汽凝固箱：北京新中大業(yè)儀表公司生產(chǎn)。② Bactec MGIT 960系統(tǒng)：美國(guó)BD公司生產(chǎn)。③ 培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司生產(chǎn)。

二、檢測(cè)方法

(一)培養(yǎng)基制備

(1) 改良羅氏培養(yǎng)基：按照《規(guī)程》進(jìn)行，每組含2支不含藥物的對(duì)照培養(yǎng)基和2支含EMB藥物的試驗(yàn)培養(yǎng)基(終濃度2 μg/ml)。(2)Bactec MGIT 960 培養(yǎng)基每組2支MGIT 培養(yǎng)管，加入0.8 ml OADC增菌劑，一支為對(duì)照管，一支為含藥管(EMB終濃度5 μg/ml)。(3) 7H9液體培養(yǎng)基每1000 ml由4.7 g 7H9干粉、2 ml甘油定容到900 ml蒸餾水中配制而成，于121 ℃高壓滅菌10 min后置4 ℃保存，臨用時(shí)加入100 ml OADC增菌劑。

(二)藥敏試驗(yàn)

126株結(jié)核分枝桿菌分別用L-J法、960法、MIC法測(cè)試其對(duì)EMB的藥物敏感性。

1.菌懸液制備：在磨菌瓶?jī)?nèi)加入1～2滴5%吐溫-80，取菌齡2～3周的結(jié)核分枝桿菌新鮮培養(yǎng)物于磨菌瓶?jī)?nèi)，漩渦震蕩后靜置10～15 min，取上清加入生理鹽水配成1個(gè)麥?zhǔn)媳葷釢舛萚3×108菌落形成單位(CFU)/ml]。L-J法中，菌液加生理鹽水稀釋至3×104CFU/ml和3×102CFU/ml；960法中，菌液稀釋至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?1.5×108CFU/ml)；MIC法中，按文獻(xiàn)報(bào)道以1∶20用7H9培養(yǎng)基稀釋菌液[12]。

2.接種、孵育、顯色： ① L-J法：方法參照《規(guī)程》執(zhí)行，對(duì)照培養(yǎng)基與含藥培養(yǎng)基分別接種3×102CFU/ml 和3×104CFU/ml菌液，37 ℃培養(yǎng)28 d后觀(guān)察結(jié)果。② 960法：分別取0.5 ml、1.5×108CFU/ml的菌液接種到對(duì)照管和含藥管中，裝入專(zhuān)用藥敏架中，掃描，置Bactec MGIT 960系統(tǒng)內(nèi)孵育(37 ℃)。③ MIC法：參照文獻(xiàn)[10]和[13]，在96孔板中每孔加入100 μl 7H9培養(yǎng)基，第1列再加入98 μl 7H9及2 μl EMB溶液(51.2 mg/ml)，倍比稀釋至第11列，得到從256～0.25 μg/ml的藥物梯度，最后一列為空白對(duì)照；每株菌接種一行，每孔加入100 μl稀釋菌液，每批次均做H37Rv為陰性對(duì)照；另做一塊空白板(不含藥)，每孔加入100 μl 7H9培養(yǎng)基和100 μl 稀釋菌液，每株菌加4個(gè)孔；微孔板用封口膜密封；37 ℃溫箱孵育5 d。第6天開(kāi)始在空白板每株菌的第1孔中加入70 μl顯色劑(Alamar blue∶5%吐溫-80=2∶5)，隔天觀(guān)察顏色變化情況，若顏色從藍(lán)色變成紫紅色或粉色，則在對(duì)應(yīng)菌株的實(shí)驗(yàn)板中每孔加入顯色劑顯色；若未變色或變色程度淺，則繼續(xù)在空白板的第2孔中加入顯色劑，直至變色(或至第4孔)為止。

3.結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)： ① L-J法：根據(jù)耐藥百分比判別，耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)×100%，若該比值大于1%，則判斷耐藥(R)，若該比值小于1%，則判斷為敏感(S)。② 960法：由Bactec MGIT 960系統(tǒng)根據(jù)生長(zhǎng)單位指數(shù)統(tǒng)計(jì)，自動(dòng)報(bào)告耐藥與敏感結(jié)果，WHO推薦的臨界濃度為5.0 μg/ml。③ MIC法： 藥物MIC被定義為藍(lán)色完全沒(méi)有發(fā)生改變的孔所對(duì)應(yīng)的藥物濃度的最小值。耐藥界定濃度為EMB≥5.0 μg/ml[13]。

三、質(zhì)量控制

每批藥敏試驗(yàn)均用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC 27294)作為敏感對(duì)照。

四、數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析處理。Kappa值在0.4～0.75為一致性較好，Kappa值≥0.75為一致性極好，Kappa值≤0.4時(shí)為一致性差[14]。

結(jié) 果

一、EMB采用3種藥敏試驗(yàn)方法檢測(cè)的結(jié)果

對(duì)126株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行EMB

的藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，3種方法藥敏試驗(yàn)結(jié)果均一致的菌株為95株，總體一致率為75.4%(95/126)。960法檢測(cè)耐藥的49株結(jié)核分枝桿菌分離株中，L-J法檢測(cè)均為耐藥，MIC法也僅1株檢測(cè)為敏感(MIC值為4.0 μg/ml)，其余均耐藥。結(jié)果的不一致性主要表現(xiàn)為16株L-J法和MIC法檢測(cè)為耐藥而960法檢測(cè)為敏感(51.6%，16/31)和13株菌株L-J法檢測(cè)為耐藥而960法和MIC法檢測(cè)為敏感(41.9%，13/31)。在不同MIC值，3種方法藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致率最低的位于MIC值為4.0～16.0 μg/ml的濃度梯度，僅為59.7%(43/72)；MIC值<4 μg/ml和>16.0 μg/ml的菌株中，3種方法一致率分別為94.7%(36/38)和100.0%(16/16)，一致性較好，見(jiàn)表1。各MIC值所對(duì)應(yīng)L-J法和960法的一致率差異，可見(jiàn)二法差異性集中體現(xiàn)的MIC值范圍，見(jiàn)圖1。

圖1 EMB藥敏試驗(yàn)各MIC值對(duì)應(yīng)的L-J法和960法一致率

二、 EMB采用3種藥敏試驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果的比較

若以L(fǎng)-J法測(cè)定結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，則960法和MIC法的敏感度、特異度和一致率分別為62.8%(49/78)、100.0%(48/48)、77.0%(97/126)和82.1%(64/78)、97.9%(47/48)、88.1%(111/126)(表2)。若以960法測(cè)定結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，則L-J法和MIC法的敏感度、特異度和一致率分別為100.0%(49/49)、62.3%(48/77)、77.0%(97/126)和98.0%(48/49)、77.9%(60/77)、85.7%(108/126)(表3)。若以MIC法測(cè)定耐藥結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，則L-J法和960法的敏感度、特異度和一致率分別為98.5% (64/65)、77.0%(47/61)、88.1%(111/126)和73.8%(48/65)、98.4%(60/61)、85.7%(108/126)(表4)。

表1 L-J法和960法EMB藥敏試驗(yàn)結(jié)果與MIC值比較(株)

注a:3種檢測(cè)方法結(jié)果一致的比率

表2 960法和MIC法EMB藥敏試驗(yàn)結(jié)果與L-J法結(jié)果比較

表3 L-J法和MIC法EMB藥敏試驗(yàn)結(jié)果與960法結(jié)果比較

表4 L-J法和960法EMB藥敏試驗(yàn)結(jié)果與MIC法結(jié)果比較

討 論

快速、準(zhǔn)確的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)是耐藥結(jié)核病防控的首要條件。然而，傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)各方法檢測(cè)結(jié)果的不一致性是各實(shí)驗(yàn)室無(wú)法避免的問(wèn)題。從國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道中可知，檢測(cè)一線(xiàn)抗結(jié)核藥物中異煙肼和利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致率不低于90%，而檢測(cè)EMB的結(jié)果一致率常處于較低水平[8-9, 12]。

本研究結(jié)果顯示：3種藥敏方法結(jié)果的一致率為75.4%。MIC值<4.0 μg/ml和>16.0 μg/ml的菌株中，3種方法一致率分別為94.7%(36/38)和100.0%(16/16)，均處于較高的水平，而MIC值4.0～16.0 μg/ml的72株菌中，僅43株藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，一致率僅59.7%，提示結(jié)果不符合的情況主要發(fā)生于低濃度耐藥的菌株中。兩兩比較中L-J法和960法一致率77.0%，而L-J法、960法均與MIC法的一致率在85.0%以上，此結(jié)果低于蔡杏珊等[15]的報(bào)道，比Krüüner等[8]報(bào)道的符合率稍高。盡管地域性和菌株耐藥程度等差異存在，但國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道通常樣本量較小，耐藥率較低，不足以說(shuō)明EMB耐藥性的實(shí)際情況。國(guó)外大樣本量研究表明：EMB藥敏試驗(yàn)結(jié)果不符的菌株，絕大部分顯示L-J法檢測(cè)為耐藥而960法敏感[8]，與本研究結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)中L-J法檢測(cè)為耐藥而960法和MIC法檢測(cè)為敏感的菌株有13株，占41.9%，同時(shí)，2株MIC值為1.0 μg/ml的菌株L-J法檢測(cè)為耐藥，提示L-J法檢測(cè)結(jié)果耐藥率偏高。此外，本研究中16株L-J法和MIC法檢測(cè)為耐藥而960法檢測(cè)為敏感(16/31，51.6%)，提示960法檢測(cè)耐藥率可能偏低。從MIC值梯度來(lái)看，不一致集中在4.0～16.0 μg/ml的藥物濃度范圍，其中14株MIC值16.0 μg/ml的菌株中，L-J法顯示均為耐藥，而960法檢測(cè)6株為敏感，亦提示960法檢測(cè)耐藥率偏低，但由于菌株數(shù)量限制，需要更大樣本量的研究來(lái)確認(rèn)或解釋此現(xiàn)象。

分析導(dǎo)致結(jié)果不一致的原因，首先可能與細(xì)菌對(duì)EMB的異質(zhì)性耐藥有關(guān)，即臨床分離株中可含有耐藥克隆和敏感克隆2種亞群，且研究認(rèn)為，EMB耐藥與菌株的基因突變有密切關(guān)聯(lián)，而基因突變會(huì)降低菌株環(huán)境適應(yīng)度[16]，導(dǎo)致耐藥株生長(zhǎng)速率比敏感株要緩慢，羅氏培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中耐藥株比敏感株要晚2～10 d生長(zhǎng)[8]。該假說(shuō)可解釋本研究中L-J法耐藥率偏高或960法(或MIC法)耐藥率偏低現(xiàn)象，即臨床分離株中耐藥克隆在L-J法中28 d后生長(zhǎng)良好而報(bào)告陽(yáng)性，而在960法和MIC法中(4～13 d)部分耐藥克隆尚未生長(zhǎng)而報(bào)告陰性。再者，L-J法耐藥率偏高還可能與制備含藥羅氏培養(yǎng)基中的高溫加熱步驟有關(guān)，而960法和MIC法中藥物未經(jīng)高溫加熱，且培養(yǎng)時(shí)間較短，不可控因素也相對(duì)減少，但此推測(cè)尚需進(jìn)一步認(rèn)證。此外，盡管960法與MIC法臨界濃度都推薦使用5.0 μg/ml，但MIC法中的臨界濃度5.0 μg/ml介于4.0～8.0 μg/ml中間，二者在MIC法讀結(jié)果時(shí)只有一孔之差，在變色與不變色的判讀中有人為因素及實(shí)驗(yàn)誤差的存在[17]；事實(shí)上，MIC值在4.0～5.0 μg/ml之間應(yīng)判定為敏感而5.0～8.0 μg/ml之間應(yīng)判定為耐藥。本研究中MIC值處于臨界濃度范圍(4.0～8.0 μg/ml)的菌株中，3種方法一致率僅為60.3%(35/58)，差異性也在一定程度上取決于此。但從表2～3可以看出，MIC法無(wú)論與L-J法還是960法比較Kappa值都在0.7以上，證明該因素在藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的判定中影響甚微。

傳統(tǒng)L-J法現(xiàn)在仍是WHO推薦的藥敏檢測(cè)方法，其簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)明顯，但耗時(shí)較久，且其制作流程中加熱對(duì)于藥物效價(jià)的影響等環(huán)節(jié)無(wú)法避免成為了其方法上的缺陷，在很多情況下無(wú)法滿(mǎn)足臨床的需要；960法現(xiàn)已越來(lái)越多地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)院的藥敏檢測(cè)，該法4～13 d即可自動(dòng)出檢測(cè)報(bào)告，敏感度和特異度較高，有利于患者的早期診斷和治療，但檢測(cè)成本較高是其無(wú)法應(yīng)用于各基層實(shí)驗(yàn)室的重要原因；MIC法也有國(guó)內(nèi)外多篇文獻(xiàn)報(bào)道，該法雖對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的技術(shù)水平要求較高，但其憑借簡(jiǎn)便、敏感、快速、價(jià)廉(比L-J法略貴)等優(yōu)勢(shì)，正越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床和科研的藥敏檢測(cè)。此外，探尋更適合臨床乙胺丁醇耐藥檢測(cè)的新方法是接下來(lái)工作亟待解決的重要問(wèn)題[18]。

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(本文編輯：王然 薛愛(ài)華)

Comparision on the detection effects of three methods forMycobacteriumtuberculosisethambutol sensitivity test

SUNQing*,ZHAOLi-li,CHENYan,ZHAOXiu-qin,WUYi-mou,WANKang-lin.

*PathogenicBiologyInstitute,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China

WANKang-lin,Email：wankanglin@icdc.cn;WUYi-mou,Email：yimouwu@sina.com

Objective To compare the detection effects and the accordance of three drug sensitivity test (DST) methods based on bacterial culture for testingMycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis) sensitivity to ethambutol (EMB). Methods One hundred and twenty-sixM.tuberculosisclinical isolates sensitivity to EMB were detected with three methods, including L-J proportion method, Bactec MGIT 960 system (960 system) and microplate Alamar blue assay (MIC assay), and their results were compared interactively. The test data were analyzed using SPSS 17.0 software. TheKappavalue between 0.4-0.75 represents moderately consistency, andKappavalue ≥0.75 shows excellent concordance, whereasKappavalue less than 0.4 means poor consistency. Results The EMB sensitivity of 126 clinicalM.tuberculosisisolates was tested by the three methods, the total consistency was 75.4%(95/126). If L-J proportion method was used as the standard control, the sensitivity, specificity and consistency of 960 system and MIC assay were 62.8% (49/78), 100.0% (48/48), 77.0% (97/126) and 82.1% (64/78), 97.9% (47/48), 88.1% (111/126), respectively. MIC method showed a better consistency with L-J proportion method (Kappa=0.76), while 960 system represented a moderate concordance with L-J method (Kappa=0.56). If 960 system were taken as the standard control, the sensitivity, specificity and consistency of 960 system and MIC assay were 100.0% (49/49), 62.3% (48/77), 77.0% (97/126) and 98.0% (48/49), 77.9% (60/77), 85.7% (108/126), respectively. Both L-J proportion method and MIC assay showed high consistency with 960 system (Kappa≥0.70). If MIC assay was set as the standard control, the sensitivity, specificity and consistency of L-J proportion method and 960 system were 98.5% (64/65), 77.0% (47/61), 88.1% (111/126), and 73.8% (48/65),98.4% (60/61), 85.7% (108/126), respectively. The inconsistency among the three methods exis-ted in the MIC value of the drug concentration range 4.0 to 16.0 μg/ml. Conclusion There were better consistency among the three detecting methods for testingM.tuberculosissensitivity to EMB, but in which discrepancies existed on a certain extent. The results between 960 system and MIC assay were superb consistent. The MIC assay is more cost-effective, and more suitable for early diagnosis ofM.tuberculosisresistance to EMB.

Mycobacteriumtuberculosis； Ethambutol； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.04.008

國(guó)家自然科學(xué)基金(81201348)；“十二五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2013ZX10003002-001)

421001 衡陽(yáng)，南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所[孫慶、吳移謀、萬(wàn)康林(特聘教授)]；中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 [孫慶(聯(lián)合培養(yǎng)研究生)、趙麗麗、陳燕、趙秀芹、萬(wàn)康林]；杭州感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心[趙麗麗、陳燕、趙秀芹、萬(wàn)康林(均為特聘研究人員)]

萬(wàn)康林， Email：wankanglin@icdc.cn；吳移謀， Email：yimouwu@sina.com

2014-11-27)