生鮮牛奶中不同類型金黃色葡萄球菌污染差異性分析

王 娟，黃秀梅，崔曉娜，蓋文燕，曲志娜，王玉東，趙思俊，王君瑋

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動物產(chǎn)品安全監(jiān)測室，山東 青島 266032；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261061）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），簡稱金葡菌，是造成人類食物中毒的常見致病菌之一，在自然界分布廣泛，因此食品受其污染的機(jī)會較多。腸毒素是金葡菌引起食物中毒的主要致病因子，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被破壞。據(jù)資料顯示，金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxin，SE）有多種類型，不同類型腸毒素的毒力強(qiáng)弱不同，其中A型腸毒素（SEA）毒力最強(qiáng)[1]，引起的食物中毒事件最多。由于金葡菌是引起奶牛乳房炎的主要原因，極易造成生鮮牛奶中金葡菌污染，金葡菌在鮮牛奶中生長繁殖過程中產(chǎn)生的腸毒素不容易通過加熱等方式分解。本文旨在了解目前我國生鮮牛奶中產(chǎn)腸毒素金葡菌污染狀況，分析產(chǎn)不同類型腸毒素金葡菌在不同區(qū)域的流行狀況，為有效控制我國牛奶中金葡菌腸毒素提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株。金黃色葡萄球菌（ATCC29213）、表皮葡萄球菌（ATCC12228），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基。7.5%NaCl肉湯、Baird-Parker瓊脂、MH肉湯、生化反應(yīng)管，均為北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)；科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，鄭州科瑪嘉生物有限公司生產(chǎn)；凍干兔血漿，廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Master Mix，美國Promega公司生產(chǎn)；瓊脂糖，西班牙Biowest生產(chǎn)；Marker 2000，寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備?？梢姺止夤舛扔?、基因擴(kuò)增儀（BIO-RAD）、凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）等。

1.1.4 樣品。在山東、湖南、內(nèi)蒙等三省區(qū)的擠奶站和奶牛場共采集鮮奶樣品360份，冷藏，24h內(nèi)運(yùn)送至實驗室。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離。取1mL牛奶樣品接種到10mL7.5%NaCl肉湯中，37℃溫箱培養(yǎng)20h后，將增菌后的液體接種于Baird-Parker平板，37℃培養(yǎng)48h，然后挑取可疑菌落接種到科瑪嘉金葡菌顯色培養(yǎng)基上。

挑取可疑菌落，劃線接種到營養(yǎng)瓊脂平板純化培養(yǎng)后，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。

1.2.2 生化鑒定。挑取純化好的單個菌落進(jìn)行觸酶試驗和血漿凝固酶試驗。觸酶試驗陽性的菌落再進(jìn)行血漿凝固酶實驗；血漿凝固酶實驗中，呈現(xiàn)凝集者該菌判為金黃色葡萄球菌。

1.2.3 金黃色葡萄球菌PCR鑒定。用DNASTAR軟件，針對金黃色葡萄球菌設(shè)計1對引物，上游引 物 P1：5'- GCGATTGATGGTGATACGGTT-3'，下 游 引 物 P2：5'- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC -3'。擴(kuò)增片段長度約為279pb。煮沸法[2]提取DNA，反應(yīng)體系（25μL）如下：上下游引 物（25pmol/μL） 各 0.5μL，DNA 模 板 1μL，Mix 12.5μL ，加ddH2O補(bǔ)至25μL。PCR循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，57℃退火50s，72℃延伸50s，擴(kuò)增36個循環(huán)；最后72℃延伸10min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含EB0.5%μg/mL），電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察并用電泳圖像分析系統(tǒng)拍照，記錄試驗結(jié)果。

1.2.4 金黃色葡萄球菌腸毒素基因擴(kuò)增。參照J(rèn)ohnson等[3]報道合成SEA、SEB、SEC、SED、SEE基因的PCR引物，根據(jù)Jarraud S等[4]報道合成SHE、SEI、SEG，根據(jù)Monday等[5]報道合成SEJ基因的PCR引物（表1）。

表1 金葡菌腸毒素引物序列

反應(yīng)體系為：上、下游混合引物（10μM）各2.0 μL，DNA 模板 1.0μL，Mix 12.5μL，加 ddH2O補(bǔ)至25μL。反應(yīng)程序為：先94℃預(yù)變性5min；再94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃終延伸10min；反應(yīng)完成后4℃保存。

1.2.5 金葡菌及其腸毒素污染差異性統(tǒng)計分析應(yīng)用SAS軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 金葡菌分離鑒定結(jié)果

2.1.1 生化鑒定結(jié)果。分離菌株生化結(jié)果：觸酶試驗陽性，葡萄糖、麥芽糖、甘露醇陽性，明膠陽性，山梨醇陰性，血漿凝固酶陽性。

2.1.2 PCR鑒定結(jié)果。以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213為陽性對照，從牛奶樣品中分離菌株能擴(kuò)增出大小約為279pb基因片段（圖1），陽性對照樣品均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小的DNA基因片段。對分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，該基因片段長度為279bp。序列結(jié)果與GenBank公布的序列同源性達(dá)99.5%以上，說明擴(kuò)增的基因片段為金黃色葡萄球菌16S-23SrRNA基因的保守區(qū)序列。鑒定結(jié)果與生化鑒定結(jié)果一致。

圖1 金黃色葡萄球菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

從采集的360份生牛奶中，檢出金黃色葡萄球菌102株，檢出陽性率為28.33%；其中從山東分離36株，湖南分離36株，內(nèi)蒙分離30株。

2.2 金葡菌腸毒素檢測結(jié)果

檢測結(jié)果顯示，102株金葡菌中，有96株產(chǎn)SEA、SEB、SEC等9種不同腸毒素基因，占94.12%，同時含2種及以上毒素的菌株有71株，占69.61%。產(chǎn)SEI的菌株最多，有86株，占84.31%。產(chǎn)其它腸毒素的有：產(chǎn)SEA的有20株，占19.61%；產(chǎn)SEB的有9株，占8.82%；產(chǎn)SEC的有5株，占4.90%；產(chǎn)SED的有 8株，占7.84%；產(chǎn)SEE的有2株，占1.96%；產(chǎn)SEG的有50株，占49.02%；產(chǎn)SHE的有39株，占38.24%；產(chǎn)SEJ的有7株，占6.86%。（圖3）。

圖2 各型腸毒素陽性菌擴(kuò)增結(jié)果

圖3 產(chǎn)不同腸毒素的菌株比例

2.3 不同區(qū)域分產(chǎn)毒素金葡菌株分布狀況

通過比較發(fā)現(xiàn)，湖南和內(nèi)蒙所有分離菌株均產(chǎn)SEA—SAJ中的不同毒素，而從山東省分離菌株中產(chǎn)SEA—SAJ中不同腸毒素的菌株占的分離菌株數(shù)的55.56%；其中湖南和內(nèi)蒙分離所有菌株均產(chǎn)SEI，而約有55.56%的山東分離菌株產(chǎn)該毒素；山東和內(nèi)蒙約有55%的分離菌株產(chǎn)SEG，而約有35%的湖南分離菌株產(chǎn)該毒素；山東和湖南分離菌株中產(chǎn)SEA的菌株均高于20%，而內(nèi)蒙只有不足10%的分離菌株產(chǎn)該毒素；山東分離株有50%的產(chǎn)SHE，而湖南和內(nèi)蒙約有30%左右的分離菌株產(chǎn)該毒素，具體見圖4。

3 討論

由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒已經(jīng)成為世界性公共衛(wèi)生問題之一[6]。本次實驗從360份生鮮牛奶中，檢出金黃色葡萄球菌102株，陽性率為28.33%；分離菌株中產(chǎn)各型腸毒素的達(dá)94.12%，同時能產(chǎn)兩種以上腸毒素的有63株，占分離菌株數(shù)的61.76%。結(jié)果說明，生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌污染較嚴(yán)重，同時，產(chǎn)各型腸毒素的菌株普遍存在，對牛奶及奶制品質(zhì)量安全造成風(fēng)險較大。

圖4 三省產(chǎn)不同金黃色葡萄球菌腸毒素菌株分布

所有分離菌株中能產(chǎn)毒性最強(qiáng)腸毒素SEA的菌株占近20.0%，這與Hazariwala等[6]報道的18.86%基本一致，遠(yuǎn)低于張嚴(yán)峻等[7]報道的食品中分離菌株產(chǎn)該型腸毒素占51.7%，這可能與檢測產(chǎn)品的單一性有關(guān)。湖南和內(nèi)蒙的所有分離菌都產(chǎn)不同型別的金黃色葡萄球菌腸毒素，山東分離菌株中55.56%的金葡菌產(chǎn)不同型別腸毒素；三個地區(qū)分離菌產(chǎn)腸毒素類型也各不相同，各地區(qū)生鮮牛奶中產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌存在明顯差異，其原因有待于進(jìn)一步研究。

檢測結(jié)果說明，我國生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的污染率處于較高水平，這與國內(nèi)相關(guān)報道相符[8-9]，主要是由于奶牛乳房炎和擠奶過程中的交叉污染造成的。因此，要防止金黃色葡萄球菌的污染，奶牛場應(yīng)定期對奶牛進(jìn)行乳房炎檢測，并將擠出的鮮奶及時冷藏保存、運(yùn)輸，降低細(xì)菌繁殖速度，減少毒素的產(chǎn)生，從源頭上降低金葡菌腸毒素對牛奶及其制品帶來的安全風(fēng)險。

本研究表明，從生鮮牛奶中分離的產(chǎn)各型腸毒素的金黃色葡萄球菌陽性率較高，且不同地區(qū)間產(chǎn)腸毒素類型有所差異。金黃色葡萄球菌引起人和動物的食物中毒事件在世界各國每年都有發(fā)生。實驗證明，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒是由其產(chǎn)生的腸毒素因子、而非活菌所致。食物中若含有足夠量的腸毒素即可引起食物中毒，癥狀為惡心、嘔吐、腹部疼痛和腹瀉[10]。由此可見，對產(chǎn)不同類型腸毒素金黃色葡萄球菌進(jìn)行研究，掌握不同地區(qū)菌株的分布狀況，對提高牛奶及其制品質(zhì)量，為食源性疾病的預(yù)防與控制提供可靠的信息和技術(shù)支持。

[1]梁毅珊.金黃色葡萄球菌腸毒素及其檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（9）：1658-1659.

[2]張雯霞.金黃色葡萄球菌腸毒素實驗分析[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，20（4）：186-188.

[3]Johnson W M，Tyler S D，Ewan E P，et al.Detection of genes for enterotoxins，exfoliative toxins and toxic shock syndrome toxin 1 in Staphylococcus aureus by the polymerase chain reaction[J]. Clin Microbiol，1991，29（3）：426-430.

[4]Jarraud S，Cozon G，Vandenesch F，etal.Involvement of enterotoxins G and I in staphylococcal toxic shock syndrome and staphylococcal scarlet fever[J].Clin Microbiol，1999，37（8）：2446-2449.

[5]Monday S R，Bohach G A.Use of multiplex PCR to detect classical and newly described pyrogenic toxin genes in staphylococcal isolates[J]. Clin Microbiol，1999，37（10）：3411-3414.

[6]Hazariwala A，Sanders Q，Hudson C R，et al.Distrebution of staphylococcal enterotoxin genes among Staphylococcus aureus isolates from poultry and humans with invasive staphylococcal disease[J]. Avian Dis，2002，46（1）：132-136.

[7]張嚴(yán)峻，張俊彥，梅玲玲，等.金黃色葡萄球菌腸毒素基因的分型和分布[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志2005，15（6）：682-684.

[8]巢國祥，焦新安.食源性金黃色葡萄球菌流行特征、產(chǎn)腸毒素特征及耐藥性研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006，16（8）：904-907.

[9]賀連華，王瑞端.食品中金黃色葡萄球菌的腸毒素檢測及耐藥性[J].職業(yè)與健康雜志，2006，22（15）：1173-1174.

[10]張傳寶，薛良輝.山東省1984-2002年金黃色葡萄球菌引起食物中毒資料分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)信息，2003，9（5）：486.