應(yīng)用液相芯片檢測空腸彎曲菌

趙 麗，蔡 陽，黃 偉，邱 楊，劉建麗，陳進會，王振國

（1.東莞出入境檢驗檢疫局，廣東東莞 523072；2.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林長春 130000）

應(yīng)用液相芯片檢測空腸彎曲菌

趙 麗1，蔡 陽2，黃 偉1，邱 楊1，劉建麗1，陳進會1，王振國2

（1.東莞出入境檢驗檢疫局，廣東東莞 523072；2.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林長春 130000）

[目的] 建立空腸彎曲菌液相芯片檢測方法。[方法] 本研究將空腸彎曲菌HIP蛋白單克隆抗體與聚苯乙烯微球偶聯(lián)，結(jié)合雙抗體夾心技術(shù)建立空腸彎曲菌液相芯片檢測方法，測定不同濃度的抗體與微球偶聯(lián)率。通過L9（34）正交設(shè)計試驗優(yōu)化方法的反應(yīng)條件，并進行靈敏度和特異性試驗。[結(jié)果] 較優(yōu)實驗條件即多克隆抗體工作濃度為1∶100、生物素標記的羊抗兔IgG工作濃度為1∶500、SA-PE的工作濃度為10ug/mL、生物素標記的抗體與SA-PE反應(yīng)時間為90min。該方法靈敏度可達103CFU/mL，與其他常見食源性致病菌無交叉反應(yīng)。[結(jié)論] 該方法靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好，可快速檢測食品中的空腸彎曲菌。

空腸彎曲菌；雙抗體夾心免疫學檢測；液相芯片檢測

空腸彎曲菌是1973年Butzler等首先自腹瀉病人糞便中分離，是人類腹瀉的主要致病菌之一[1]。空腸彎曲菌病世界各地均有發(fā)生，而且逐年有增加的趨勢。多次報道由污染食物、奶品和水源引起的空腸彎曲菌腸炎暴發(fā)，每次累及數(shù)百人，甚至數(shù)千人[2]。在發(fā)展中國家如南非、孟加拉等幼兒腹瀉中檢出率高達40%，呈散發(fā)或地方流行。在歐美等發(fā)達國家，C. jejuni 是造成腹瀉的主要病原體，有時甚至超過沙門氏菌和志賀氏菌，居首位[3]。因此，建立快速而有效的空腸彎曲菌的檢測方法一直以來是食品安全的研究熱點之一。

雖然空腸彎曲菌的傳統(tǒng)檢測方法可操作性強，但操作繁瑣復(fù)雜，特異性、敏感度均低，不能適應(yīng)

衛(wèi)生應(yīng)急檢測的需要[4]。當今，分子生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展，基因診斷與分型方法因其敏感性、特異性、分型率和分辨力極高而備受重視。基因芯片是在多種微生物基因組序列被確定之后出現(xiàn)的一種新興檢測技術(shù)[5]?；蛐酒夹g(shù)雖然有多方面的優(yōu)越性，但在實際應(yīng)用中存在檢測成本高、設(shè)計要求嚴格等的局限性，所以不能廣泛用于基層單位的檢測工作[6]。

本研究將空腸彎曲菌HIP蛋白單克隆抗體與聚苯乙烯微球偶聯(lián)，結(jié)合雙抗體夾心免疫學檢測模式，建立了空腸彎曲菌液相芯片檢測方法并進行初步應(yīng)用，為今后研究及檢測工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株?？漳c彎曲桿菌（33560、ATCC33291）、大腸桿菌O157（54144172）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、單核細胞增生性李斯特氏菌（ATCC33090、 ATCC54002）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（ATCC13124）、腸炎沙門氏菌（50041-14）、綿羊李斯特氏菌（ATCC19111）、傷寒沙門氏菌（50071-7）、大腸埃希菌（44102-20）、蠟樣芽胞桿菌（63301-14）、霍亂弧菌（JL080118）、沙門氏菌（ATCC9150）、綠膿桿菌（ATCC27853）、志賀氏菌（JL08036）、阪崎桿菌（JL08106）、糞腸球菌（ATCC14506）、變形桿菌（ATCC35659）均由吉林出入境檢驗檢疫技術(shù)中心生物實驗室保存。

1.1.2 生物試劑（抗原抗體）。捕獲抗體：空腸彎曲菌單克隆抗體（Ca.j mAb）；檢測抗體：空腸彎曲菌多克隆抗體（Ca.j pAb）；生物素標記抗抗體：經(jīng)活化的生物素標記的羊抗兔IgG（biotin-羊抗兔IgG）；biotin-羊抗鼠IgG：用于測定偶聯(lián)效果，確定單抗最佳偶聯(lián)濃度

1.1.3 化學試劑。牛血清白蛋白（BSA），購自北京鼎國生物有限公司；1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、鏈霉親和素-藻紅蛋白（SA-PE），購自北京晶美有限公司；活化緩沖液：0.1 M的磷酸鹽緩沖液（pH 6.2），0.2μL 濾器過濾；偶聯(lián)緩沖液：50 mmol/L、pH 6.2的2-（N-嗎啡啉）乙磺酸[2-（N-Momphdino）ethanesulfonicacid，MES] ，0.2 μL 濾器過濾；封閉終止液：磷酸鹽緩沖酸鹽緩沖液（pH7.4）Tween-20（0.05% v/v），0.2 μL 濾器過濾；鞘液，購自美國QIAGEN公司；聚苯乙烯熒光微球，編號為25，內(nèi)標熒光素，直徑5.5μm，購自美國Luminex公司。

1.1.4 儀器設(shè)備。液相芯片儀（QIAGEN，Luminex 100 IS）、懸浮芯片檢測儀、酶標儀平臺、超聲波清洗器、漩渦震蕩器、離心機、恒溫培養(yǎng)箱、純水機等。

1.2 方法

1.2.1 單克隆抗體最佳工作濃度確定。將35號微球原液室溫放置30min，超聲10min，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布。按照Luminex推薦的單克隆抗體與微球偶聯(lián)步驟進行操作，其中將空腸彎曲菌單克隆抗體稀釋成25、50、75、100、125、150、175、200、225、250μg/mL。偶聯(lián)后加入500μL PBS（1%BSA，0.05%疊氮鈉，0.01mol/ LPBS，pH=7.4），重懸微球，37℃，搖床孵育2h進行封閉。每個濃度樣品取2 μL加入10 μL500倍稀釋的生物素標記羊抗鼠IgG，37℃，120 r/ min，搖床1h。然后14000r/min，離心5min，棄上清，用PBS-TBN洗滌。加入10μL終濃度為8 μg/mL SA-PE，37℃搖床120r/min，30min。離心棄上清，洗滌，重懸于PBS-TBN中，使用Luminex100測定熒光強度中值（MFI）。其中MFI值最大的濃度為單克隆抗體最佳工作濃度。

1.2.2 單克隆抗體與微球的偶聯(lián)。根據(jù)上述實驗確定單克隆抗體最佳工作濃度，將單克隆抗體用500μL偶聯(lián)液稀釋至最佳濃度與微球偶聯(lián)，最后重懸于500μL1%BSA PBS中，37℃水浴搖床孵育2h進行封閉。應(yīng)用Luminex 100進行計數(shù)，封閉后取出4℃保存。

1.2.3 檢測方法的建立。將已偶聯(lián)微球混合液室溫放置30min后震蕩3min，取約5000個微球，加入10μL空腸彎曲菌（108CFU/mL），再加PBSTBN至100μL。37℃，120r/min，搖床1h。離心棄上清，洗滌。加入稀釋的空腸彎曲菌多克隆抗

體10μL，加PBS-TBN至100μL。37℃，120 r/ min，搖床1h。離心棄上清，洗滌。然后加入稀釋的生物素標記羊抗兔IgG 10 μL，加PBS-TBN至 100 μL。搖床37℃，1 h。離心棄上清，洗滌。加入SA-PE，加PBS-TBN至100 μL，37℃搖床，取出后離心棄上清，洗滌。重懸于PBS-TBN，使用Luminex100測定MFI。

L9（34）正交設(shè)計試驗篩選出對實驗影響顯著的四個因素即多克隆抗體濃度，生物素標記二抗?jié)舛?，SA-PE濃度，生物素標記二抗與SA-PE反應(yīng)時間，并把每個因素設(shè)置3個水平，設(shè)計因素水平級表通過正交表L9（34）來設(shè)計實驗，確定最優(yōu)條件。

1.2.4 靈敏度檢測。用PBS緩沖液將純培養(yǎng)的金葡菌以10倍梯度稀釋，取108～102CFU/mL應(yīng)用已建立的方法進行檢測。每組試驗重復(fù)3次，將三次都檢出的細菌濃度作為靈敏度。

1.2.5 特異性檢測。通過檢測9種常見食源性致病菌評價方法檢測目標菌的特異性，每組試驗重復(fù)3次。

1.2.6 人工添加樣品的檢測。取樣本25g加入225mL的LB培養(yǎng)基中，分別加入100、101、102、103CFU/mL空腸彎曲菌懸液1mL，37℃微需氧培養(yǎng)6h。培養(yǎng)后，取2mL上清，煮沸滅菌，各取10μL用于檢測。每組試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 捕獲抗體最佳工作濃度的確定

從圖1可以看出，當單克隆抗?jié)舛葹?50ug/ mL時，其MFI值達到最大，故最佳單克隆抗體工作濃度為250ug/mL。

圖1 偶聯(lián)優(yōu)化結(jié)果圖

2.2 正交實驗結(jié)果—確定反應(yīng)較優(yōu)條件

根據(jù)表1結(jié)果可知實驗條件A1B1C5D5為較優(yōu)實驗條件，即多克隆抗體工作濃度為1∶100，生物素標記的羊抗兔IgG工作濃度為1∶500，SA-PE工作濃度為10ug/ml，生物素標記的抗體與SA-PE反應(yīng)時間為90min。

表1 正交試驗優(yōu)化結(jié)果表

2.3 靈敏度檢測結(jié)果

由圖2可以看出，在細菌濃度達到103CFU/ mL時仍可被檢出。因此本方法靈敏度較高，達103CFU/mL。

2.4 特異性檢測結(jié)果

用所建立的方法分別檢測空腸彎曲桿菌（ATCC33291）、單增李斯特菌（ATCC54002）、霍亂弧菌（JL080118）、沙門氏菌（ATCC9150）、綠膿桿菌、志賀氏菌（JL08036）、阪崎桿菌

（JL08106）、糞腸球菌（ATCC14506）、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌，從圖3可看出此方法特異性良好，與其它細菌無交叉反應(yīng)。

圖2 靈敏度檢測結(jié)果

圖3 液相芯片檢測Ca.j與其他細菌交叉試驗結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗

分別在第1、5、7天，用此方法檢測陽性菌和陰性菌，由圖4可見，陽性菌和陰性菌MFI值上下浮動都不大，證明本方法重復(fù)性較好。

圖4 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 實物樣品添加空腸彎曲菌的檢測結(jié)果

分別在綠豆和兔肉中添加空腸彎曲菌、沙門氏菌，并做空白對照。由表2可見用本方法檢出了添加空腸彎曲菌實物樣品中的空腸彎曲菌。

表2 液相芯片方法對樣品實測結(jié)果

3 討論

當前對食源性病原菌的檢測已經(jīng)有多種方法，如傳統(tǒng)的生化檢測方法、免疫學檢測方法、PCR技術(shù)及核酸探針等。這些方法雖然是可提供相對敏感特異的定量方法，但一次僅能檢測一種病原菌，當用于多種病原菌檢測時變得繁瑣費時。液相芯片技術(shù)，與其它幾種檢測方法相比，優(yōu)勢在于檢測樣品數(shù)量和檢測項目數(shù)量雙向高通量、靈活性好、靈敏度高、信噪比好、操作簡便、標準曲線范圍寬和應(yīng)用范圍廣等方面，現(xiàn)已應(yīng)用于抗原檢測、抗體檢測和核酸檢測領(lǐng)域[6]。作為生物信息學先進的操作平臺，在臨床診斷、獸醫(yī)傳染病診斷、食品微生物檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

本文以空腸彎曲菌為檢測對象，對空腸彎曲菌液相芯片的檢測條件進行了優(yōu)化。運用優(yōu)化的反應(yīng)體條件進行特異性試驗，空腸彎曲菌的熒光值高達12000，而其他細菌的熒光值則不足2000，說明其特異性強，能很好的避免交叉性反應(yīng)。液相芯片儀每次使用50 μL菌液，檢測最低限為103CFU/mL，而VIDAS檢測儀最低限為107CFU/mL，說明液相芯片儀檢測的線性范圍更大。為大量檢測食品中的病原菌打下堅實的基礎(chǔ)。

本研究對空腸彎曲菌液相芯片的制備條

件進行了優(yōu)化，獲得了與目前常用的常規(guī)檢測方法相同的檢測結(jié)果，且檢測范圍更廣，為進一步研究其他食源性病原菌的液相芯片提供了實驗依據(jù)。

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The Establishment of Liquid Chip Technique for Detection of Camplobacter jejuni

Zhao Li1，Cai Yang2，Huang Wei1，Qiu Yang1，Liu Jianli1，Chen Jinhui1，Wang Zhenguo2
（1.Dongguan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dongguan，Guangdong 523072；
2.Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changchun，Jilin 130000）

[Objective] The aim of the study is to establish liquid chip method for detection of Camplobacter jejuni. [Method] HIP protein monoclonal antibody against Camplobacter jejuni was coupled with polystyrene microspheres and a liquid chip method was established for detection of Camplobacter jejuni in combination with double antibody sandwich technique. The coupling rate of different antibody concentration with the microsphere was determined. The reaction conditions were optimized through L9（34）orthogonal design test，and the developed method was evaluated for its sensitivity and specificity. [Result] The results showed that the optimal test conditions were：the working polyantibody concentration was 1∶100，the working concentration of biotin labeled goat anti rabbit IgG was 1∶500，the working concentration of SA-PE was10ug/mL and the reaction time of biotin labeled antibody and SA-PE was 90min. The sensitivity of the assay reached 103CFU/mL，without cross reaction with other common food borne pathogenic bacteria. [Conclusion] The method was of high sensitivity，specificity and reproducibility and could be used for rapid detection of Camplobacter jejuni in food.

Camplobacter jejuni；double antibody sandwich immunoassay；liquid phase chip detection

R378.3

A

1005-944X（2015）04-0079-05

廣東出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（2013GDK02）

蔡 陽