以雞鴨紅細胞作血凝抑制指示劑檢測鴨高致病性禽流感抗體的比較

錢昌銀，程幫照，季晶晶，劉 華

（1.合肥市動物疫病預(yù)防控制中心，安徽合肥 230091；2.宣城市動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽宣城 242000；3.滁州市動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽滁州 239000；4.安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 230091）

以雞鴨紅細胞作血凝抑制指示劑檢測鴨高致病性禽流感抗體的比較

錢昌銀1，程幫照2，季晶晶3，劉 華4

（1.合肥市動物疫病預(yù)防控制中心，安徽合肥 230091；2.宣城市動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽宣城 242000；3.滁州市動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽滁州 239000；4.安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 230091）

[目的]分別以雞和鴨紅細胞（RBCs）作指示劑，檢測鴨體內(nèi)高致病性禽流感病毒血凝抑制（HI）抗體結(jié)果的一致性。[方法] 在對360份鴨血清進行H5亞型高致病性禽流感病毒（Re-6株）HI抗體檢測時，分別使用1%雞紅細胞懸液和1%鴨紅細胞懸液做指示劑，觀察結(jié)果，計算陽性率、陽性一致性、陰性一致性、符合率，并進行Kappa檢驗。 [結(jié)果] 1%鴨紅細胞懸液作指示劑的陽性率（76.7%）顯著高于雞的（5.8%），且有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。兩種方法共同檢出13份抗體陽性和76份陰性，陽性一致性為61.9%（95%置信區(qū)間：41.1%-82.7%），陰性一致性為22.4%（95%置信區(qū)間：18.0%-26.9%），符合率24.7%（95%置信區(qū)間：20.3%-29.2%），Kappa值為-0.023（95%置信區(qū)間：-0.051-0.004）。[結(jié)論] 2種紅細胞作指示劑的檢測結(jié)果陽性率有顯著差異，結(jié)果一致性強度為極差。

Kappa檢驗；鴨；高致病性禽流感；抗體；血凝抑制試驗；紅細胞

禽流感是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一種禽類傳染病，H5N1高致病性禽流感嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展[1-3]。加強高致病性禽流感的疫苗接種和抗體監(jiān)測是我國防控禽流感的重要舉措。血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）是目前國內(nèi)外普遍采取的實驗室檢測禽流感抗體的方法[4]。國內(nèi)常依照GB/T18936—2003進行[5]。實際操作中發(fā)現(xiàn)，對水禽進行抗體檢測時如果使用雞紅細胞做指示細胞，常常存在非特異性凝集現(xiàn)象[4，6]。本文分別使用雞和鴨紅細胞作指示劑，對同一組鴨血清進行高致病性禽流感抗體檢測，比較二者結(jié)果的一致性，為科學(xué)評價其免疫效果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

高致病性禽流感疫苗（H5N1滅活苗，Re-6株）免疫鴨21天以后采集鴨血清，常規(guī)方法離心后-20℃保存。合肥、宣城、滁州3市各120份，由安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心實驗室提供。

1.2 主要試劑

禽流感病毒H5亞型（Re-6株）血凝抑制抗原購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，批號：2013001；禽流感病毒H5亞型（Re-6株）陽性血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，2013001；1%雞紅細胞懸液和1%鴨紅細胞懸液，按GB/ T18936-2003方法配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 方法

按《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/ T18936—2003）進行HA及HI試驗，測定禽流感病毒H5亞型（Re-6株）抗體效價。HI試驗時使用不同家禽的紅細胞懸液。使用1%雞紅細胞懸液的，進行HI試驗前，血清經(jīng)預(yù)處理[7]。即取25μL血清56℃水浴30min，取出加入25μL1%雞紅細胞懸液，輕搖后室溫靜置30min，800×g離心5min，取25μL上清做倍比稀釋。使用1%鴨紅細胞懸液的，進行HI試驗時血清直接倍比稀釋。然后，除最后一步加紅細胞懸液不同外，其他步驟均同國標。

1.4 結(jié)果判定

農(nóng)業(yè)部《高致病性禽流感防治技術(shù)規(guī)范》規(guī)定HI價≥24為陽性[8]。由于使用1%雞紅細胞懸液的，對鴨血清進行了預(yù)處理，相當于稀釋了一倍，因此HI價≥23判為陽性，反之為陰性；而使用1%鴨紅細胞懸液的，HI價≥24判為陽性，反之為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對2種指示劑檢測的HI抗體陽性率進行χ2檢驗；采用Kappa 檢驗結(jié)果一致性。Kappa系數(shù)<0，極差；0～0.2，微弱；0.21～0.4，弱；0.41～0.6，中度；0.61～0.8，高度；0.81～1.0，極強[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同指示劑檢測結(jié)果

360份鴨血清中，使用1%雞紅細胞懸液作指示劑，共檢出禽流感病毒H5亞型（Re-6株）血凝抑制抗體21份陽性，陽性率5.8%；使用1%鴨紅細胞懸液共檢出276份陽性，陽性率76.7%，高于前者的結(jié)果（χ2= 239.94，p<0.01）。結(jié)果見表1。

表1 2種不同指示劑檢測鴨H5亞型禽流感病毒（Re-6株）HI抗體結(jié)果

2.2 不同指示劑檢測結(jié)果的一致性

使用兩種紅細胞的陽性結(jié)果一致性為61.9%（95%置信區(qū)間：41.1%～82.7%），陰性結(jié)果一致性為22.4%（95%置信區(qū)間：18.0%～26.9%），總體樣本結(jié)果的一致率為24.7%（95%置信區(qū)間：20.3%～29.2%）。經(jīng)SPSS20.0統(tǒng)計軟件Kappa一致性檢驗，Kappa值為-0.023（95%置信區(qū)間：-0.051～0.004），結(jié)果兩種指示劑的檢測結(jié)果一致性強度為極差。

3 討論

血凝和血凝抑制試驗作為檢測禽流感的常規(guī)方

法，是一種在基層臨床應(yīng)用中極易推廣的檢驗、檢疫手段與診斷方法。用雞紅細胞作指示劑檢測水禽血清的HI抗體時，有些禽的血清可能對雞紅細胞產(chǎn)生非特異性凝集，有時能嚴重影響結(jié)果的判定[4，6，10，11]。鑒于此，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）建議用雞紅細胞對試驗血清進行吸附，以除去非特異性凝集素，也可以用被檢禽種的紅細胞直接檢測[7]。為此，用這兩種方法對同一組鴨血清進行了檢測并對結(jié)果進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果二者一致性極差。在沒有金標準的情況下，這表明用雞、鴨紅細胞作指示劑至少有一種試驗方法的敏感性和特異性是比較差的。二者一致性差可能與本次試驗使用的雞或鴨的品種、雞紅細胞消除非特異性凝集素的效率等因素有關(guān)[4]，但有待進一步研究。

按農(nóng)業(yè)部規(guī)定，H5亞型禽流感滅活疫苗免疫家禽21天后HI價≥24為免疫合格，禽群免疫抗體合格率≥70%為合格[12]。如果檢測時用鴨紅細胞作指示細胞，免疫效果能達到國家要求；但如果用雞紅細胞，合格率僅為5.8%，遠遠低于國家要求。因此，進行HI抗體檢測時選用紅細胞的種類，對禽群免疫抗體真實水平的評估有直接影響。

有試驗表明，水禽HI抗體檢測時使用被檢禽種的紅細胞比用雞的紅細胞效價要高2～4log2[13，14]。應(yīng)用Kappa檢驗分析不同指示細胞檢測HI抗體結(jié)果一致性，進一步證實了類似研究的結(jié)果，從而為科學(xué)選擇指示細胞和評價免疫抗體效果提供了另一個重要參考依據(jù)。一般認為，檢測鴨血清HI抗體時用鴨紅細胞可消除非特異性凝集現(xiàn)象[15，16]，結(jié)合本次試驗結(jié)果，建議在進行動物禽流感HI抗體檢測時，使用同種動物的RBCs作指示細胞。

[1] 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所.動物傳染病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：438-441.

[2] 南京農(nóng)業(yè)大學(xué).家畜傳染病學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1993：360-361.

[3] 甘孟候.中國禽病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：742-761.

[4] 張麗萍，張麗麗，張改平，等.禽流感病毒診斷技術(shù)研究進展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008，6：12-13.

[5] 農(nóng)業(yè)部.GB/T18936—2003 高致病性禽流感診斷技術(shù)[S].北京：中國標準出版社，2003-01-10.

[6] 鄧波，李凱航，薛霞，等. 禽流感血凝抑制試驗中鴨血清非特異性凝集因子去除方法研究[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31（7）：39-41.

[7] 世界動物衛(wèi)生組織. 農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局/中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，譯.5版. 陸生動物診斷試驗和疫苗手冊（哺乳動物、禽鳥和蜜蜂）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：229.

[8] 農(nóng)業(yè)部. 《高致病性禽流感防治技術(shù)規(guī)范》等14個動物疫病防治技術(shù)規(guī)范[EB/OL]. （2007-07-16）[2007-07-16]. http：//111.205.51.12∶8080/pub/MainSite/ybfk/200707/ t20070716_40752.html.

[9] 劉華，詹松鶴，何長生，等.應(yīng)用Kappa檢驗比較豬藍耳病ELISA抗體檢測試劑盒[J].中國動物檢疫，2014，31（11）：95-96.

[10] Shortridge K F，Lansdell A. Serum inhibitors of A2/ HongKong influenza virus hemagglutination [J]. Microbios，1972，6：213-219.

[11] William F. Friedewald，Edward S. Miller，L.Ross Whatley.The nature of non-specific inhibition of virus hemagglutination [J]. J Exp Med，1947，86（1）：65-75.

[12] 農(nóng)業(yè)部.關(guān)于印發(fā)2014年國家動物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計劃的通知 [EB/OL]. （2014-03-20）[2014-03-20].

http：//www.moa.gov.cn/zwllm/ghjh/201403/t20140325 _3827856.htm .

[13] 詹松鶴，劉華. 不同家禽紅細胞懸液檢測水禽禽流感抗體對比試驗[J].畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（5）：11-12.

[14] 胡祖余.用鴿、雞紅細胞進行禽流感血凝抑制試驗的比較[J].中國獸醫(yī)雜志，2013，49（3）：35-36.

[15] 吳峻華，邱艷紅，葉瑋，等.用鴨紅細胞懸液消除非特異性凝集因子對鴨禽流感HI試驗的影響[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2006，（12）：5-6.

[16] 張評滸，唐應(yīng)華，仇旭升，等.不同家禽紅細胞懸液對禽流感血清抗體檢測的影響[J].中國獸醫(yī)科技，2005，35（4）：267-271.

A Comparison of HI Test for Detection of HPAIV Antibody in Ducks with Chicken and Duck Red Blood Cells as Indicators

Qian Changyin1，Cheng Bangzhao2，Ji Jingjing3，Liu Hua4
（1. Hefei Center for Animal Disease Control and Prevention，Hefei，Anhui 230091；2. Xuancheng Center for animal Disease Control and Prevention，Xuancheng，Anhui 242000；3.Chuzhou Center for Animal Disease Control and Prevention，Chuzhou，Anhui 239000；4. Anhui Center for Animal Disease Control and Prevention，Hefei，Anhui 230091）

To compare the consistency of the results of antibody against highly pathogenic avian influenza virus （HPAIV）in ducks by hemagglutination inhibition test with chicken or duck red blood cell （RBC） as indicators，360 duck serum samples were tested for H5 subtype HPAIV （Re-6 strain） antibody by HI test with 1% chicken and duck RBCs as indicators respectively. Test results were observed，the positive rate，the positive and negative consistence，the coincidence rate were calculated，and consistence was determined by Kappa test. The positive rate （76.7%） of HI antibody with 1% duck RBC was higher than that with chicken RBC（5.8%），suggesting a statistically significant difference（p<0.01）. 13 positive and 76 negative were detected with the two indicators together with a positive consistence of 61.9%（95%CI∶741.1%-82.7%） and a negative consistence of 22.4%（95% CI∶18.0%-26.9%），and a coincidence of 24.7%（95%CI∶ 20.3%-29.2%）.The Kappa value was -0.023（95%CI∶ -0.051-0.004）. The results showed that there was a significant difference between the two positive rates of the HI tests with chicken or duck RBC as indicators，and a poor consistency between them.

Kappa test；duck；high pathogenic avian influenza（HPAI）；antibody；hemagglutination inhibition（HI）test；red-blood cell （RBC）

S858.28

B

1005-944X（2015）04-0060-03

劉 華