淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒快速核酸檢測方法

熊 煒，林穎崢，魏曉鋒，王 艷，張 強(qiáng)，李 健，胡建華，黃忠榮

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203）

淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒快速核酸檢測方法

熊 煒1，林穎崢1，魏曉鋒2，王 艷1，張 強(qiáng)1，李 健1，胡建華2，黃忠榮1

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203）

為加強(qiáng)口岸對進(jìn)境野生及實(shí)驗(yàn)用嚙齒類動(dòng)物中淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）篩查和流行病學(xué)調(diào)查，本研究建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR快速高通量檢測LCMV的方法，證實(shí)兩種核酸檢測方法具有良好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性，適于快速檢測LCMV。

淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒；RT-PCR；Real-time RT-PCR；Taqman探針

淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）引起的淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎，是一種嚙齒類動(dòng)物多發(fā)急性人畜共患傳染病，其臨床經(jīng)過可有流行性感冒樣癥狀至腦膜炎、腦炎等程度不等的表現(xiàn)，病程具有自限性[1，2]。LCMV在自然狀態(tài)下可感染鼠、犬、貓、猴等多種動(dòng)物和人類，其儲存宿主包括小家鼠（Mus musculus）、家鼠（Mus domesticus）和倉鼠（Syrian hamster）等嚙齒類動(dòng)物[3-5]。美國一家癌癥研究所1989 年發(fā)生的LCMV感染事件就從該研究所飼養(yǎng)的裸鼠中檢測到LCMV陽性，并且有實(shí)驗(yàn)人員在對裸鼠進(jìn)行腫瘤手術(shù)時(shí)被感染[2]。由于此類嚙齒類動(dòng)物遍布全球，廣泛分布在人類的活動(dòng)區(qū)域，人被感染LCMV的幾率也較大。人感染LCMV的主要途徑是直接接觸帶毒動(dòng)物排泄物和分泌物。成年人感染LCMV后8 ～13天出現(xiàn)臨床癥狀，其典型表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉痛、嘔吐等類似流感樣癥狀，偶有單側(cè)睪丸痛、妄言等癥狀；嚴(yán)重者表現(xiàn)為腦膜炎、聽力下降；約三分之一的患者沒有臨床癥狀。LCMV為自限性疾病，致死率很低，人在感染l ～3周后能自行恢復(fù)，且通常預(yù)后良好。此外，曾有報(bào)道，LCMV可經(jīng)母嬰垂直傳播導(dǎo)致嬰兒畸形或出生后死亡，但經(jīng)該途徑傳播的流行病學(xué)和臨床癥狀還未完全清楚[6]。目前檢測LCMV的方法主要有血清中和、免疫熒光、免疫組化、ELISA和RT-PCR等，這些傳統(tǒng)檢測方法受試樣本具有一定的局限性，同時(shí)操作繁瑣且靈敏度較低[7～10]。Real-time PCR技

術(shù)是一種新型的核酸檢測技術(shù)，具有操作簡便、敏感性高、適用于高通量核酸檢測的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用病原微生物核酸的檢測[11～12]。鑒于LCMV隱性感染的特征及人畜共患的危害性，為了加強(qiáng)對入境野生和實(shí)驗(yàn)用嚙齒類動(dòng)物中LCMV疫情篩查和流行病學(xué)調(diào)查，提高LCMV隱性攜帶動(dòng)物的檢出率，本研究建立了Real-time RT-PCR快速高通量檢測LCMV的方法，并將其與RT-PCR方法進(jìn)行對比，評估建立的LCMV核酸檢測方法的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑。Trizol購自Invitrogen公司；Taq酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、隨機(jī)引物、DNA Marker（DL2000）購自Takara公司。

1.1.2 病毒樣品來源及處理。LCMV陽性組織樣品、血清和細(xì)胞培養(yǎng)物源自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。陽性組織樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3000 g離心15 min，收集上清液待檢。本研究使用的其他病毒，如小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）、小鼠肺炎病毒（pneumonia virus of mice，MPV）、仙臺病毒（Sendai virus，SV）、呼腸孤病毒3型（reovirus type 3，Reo-3）、小鼠小病毒（minute virus of mice，MVM）均來自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。上述病毒樣品經(jīng)核酸分離提取制備成DNA或cDNA備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提及cDNA模板制備。取100 μL待檢上清液或血清，加1 mL Trizol試劑，用槍頭吹打20～30次；加入200μL氯仿，渦旋震蕩30 s混勻；12000 r/min離心15 min；取上層水相，加500 μL異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置20 min；12000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀用1 mL DEPC水配制的75%乙醇清洗；7500 r/min離心10 min；棄上清，沉淀室溫干燥10 min；加30 μL DEPC水溶解RNA沉淀。取11 μL RNA溶液，加5倍逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩沖液4 μL、dNTP 1 μL、隨機(jī)引物1 μL、RNA酶抑制劑1 μL、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL，置PCR儀上42℃反應(yīng)60 min，即得cDNA模板。

1.2.2 RT-PCR檢測。正向引物（LCMVF）：5’AGT GAT GAG TCC TTC ACA TCC CA 3’，反向引物（LCMVR）：5’ GGA TCC TAG GCA TTT GAT TGC GC 3’，該引物針對LCMV的S基因的保守序列設(shè)計(jì)，其擴(kuò)增基因片段大小為554 bp。在PCR薄壁管中，加cDNA模板2 μL、10倍Taq酶濃縮緩沖液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq酶0.25 μL，加水補(bǔ)足總體積至25 μL。將PCR管置PCR儀上，按如下程序擴(kuò)增 ：首先94℃ 3 min；然后94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 3 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)拍攝。

1.2.3 Real-time RT-PCR引物和TaqMan探針。使用Vector NTI Suite軟件分析不同國家和地區(qū)分離的LCMV基因的保守序列，用Primer Express軟件設(shè)計(jì)引物和TaqMan MGB探針，正向引物（TLCMVF） 為：5’ AGC AAC TTC CAC CGG ATC AT 3’，反向引物（TLCMVR）為：5’ TTG ATC CAA ATG CAC CCA CAT 3’，TaqMan MGB探針為 ：5’ CTA CCC TCA ATG TCT ATC 3’。引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成，引物和探針的濃度均為25 μM。

1.2.4 Real-time RT-PCR檢測。采用ABI公司ViiA7熒光PCR儀。反應(yīng)體系為：10倍Taq酶濃縮緩沖液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、Taq酶0.25 μL、模板1 μL、上下游引物（TLCMVF、TLCMVR）各0.25 μL、TaqMan探針0.25 μL，加水補(bǔ)足總體積至25 μL。反應(yīng)條件為：首先95℃ 3 min；然后95℃ 15 s，59 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)第二步收集熒光信號。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測LCMV的特異性試驗(yàn)

針對LCMV基因保守序列，建立RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測LCMV方法。通過對比檢測LCMV和其它鼠病毒，如MHV、MPV、SV、

Reo-3和MVM等，證實(shí)建立的RT-PCR方法和Real-time RT-PCR方法均具有良好的特異性。RTPCR僅擴(kuò)增出了LCMV中的特異性基因片段，且條帶單一（圖1）；Real-time RT-PCR僅在LCMV陽性樣本18個(gè)循環(huán)左右出現(xiàn)顯著擴(kuò)增，其對照病毒樣品未見擴(kuò)增（圖2）。

圖1 RT-PCR檢測LCMV的特異性

圖2 Real-time RT-PCR檢測LCMV的特異性

2.2 RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測LCMV的敏感性試驗(yàn) 將LCMV陽性樣品cDNA進(jìn)行定量并梯度稀釋，制備濃度分別為10 ng/μL、1 ng/ μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/ μL、10 fg/μL、1 fg/μL的模板，再用建立的兩種方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，RT-PCR檢測LCMV陽性cDNA模板的下限量為10 pg（圖3），而Real-time RT-PCR檢測LCMV cDNA模板的下限量為10 fg（圖4）。

圖3 RT-PCR檢測LCMV的敏感性試驗(yàn)

圖4 Real-time RT-PCR檢測LCMV的敏感性試驗(yàn)

2.3 RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測LCMV的可靠性試驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證所建LCMV核酸檢測方法的可靠性，將15份LCMV陽性病料和細(xì)胞培養(yǎng)物，以及40份健康小鼠的不同組織樣品，使用所建RT-PCR和Real-time RT-PCR方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，15份LCMV陽性樣品經(jīng)RTPCR和Real-time RT-PCR檢測均呈陽性（Ct值16.5～31.0），其余40份LCMV陰性樣本經(jīng)兩種方法檢測均為陰性（Ct值>38.0）。

3 討論

研究表明，實(shí)驗(yàn)鼠感染LCMV有以下幾種途徑：第一，由野鼠污染引起，由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼料充足，環(huán)境適宜，很容易吸引野鼠，從而將LCMV帶入，飼養(yǎng)在底層的小鼠比飼養(yǎng)在上層的小鼠血清檢測LCMV陽性率更高，原因可能是野鼠的糞便和分泌物污染了動(dòng)物房的地板或低矮設(shè)施；第二，經(jīng)實(shí)驗(yàn)感染，如腫瘤移植手術(shù)，這樣的污染原因是由細(xì)胞株或是實(shí)驗(yàn)器具被LCMV污染；第三，不同單位間大量動(dòng)物交流或進(jìn)出動(dòng)物房人員太多而引起；第四，運(yùn)輸過程中感染。近年來實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)CMV感染率一直保持較低水平，這與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物硬件設(shè)施和管理水平的提高密不可分，更說明，

做好入境引種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)CMV監(jiān)測意義重大。

目前LCMV很少有在鼠群內(nèi)急性暴發(fā)報(bào)道，絕大多數(shù)為不發(fā)病無癥狀的隱感染。由于傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法靈敏度低，因此其漏檢率較高。同時(shí)，由于LCMV的宿主范圍較廣且可在環(huán)境中長期存活，因此提高檢測方法的敏感性，是降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染LCMV的重要保障。

為了適應(yīng)口岸對大量入境實(shí)驗(yàn)用嚙齒類動(dòng)物和野生動(dòng)物快速檢測LCMV的需要，本研究建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR快速檢測LCMV的方法。這些方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，同時(shí)操作簡便、迅速，其中Real-time RTPCR還是一種高通量的核酸檢測技術(shù)，非常適合應(yīng)用于口岸一線檢疫實(shí)驗(yàn)室開展LCMV疫情監(jiān)測。由于LCMV同時(shí)是一種人畜共患病，本研究建立的檢測方法針對的樣本廣泛，除血液樣本外，還可以是糞便、口鼻分泌物和組織樣本等，這有助于提高口岸檢疫人員采樣的安全性，降低被動(dòng)物咬傷、感染的幾率。

[1] Oldstone MB．Lessons learned and concepts formed from study of the pathogenesis of the two negative-strand viruses lymphocytic choriomeningitis and influenza[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（11）：4180-4183．

[2] Zhou X，Ramachandran S，Mann M，et al．Role of lymphocytic choriomeningitis virus（LCMV）in understanding viral immunology：past，present and future[J]. Viruses，2012，4（11）：2650-2669．

[3] 李雨函，魏強(qiáng)．淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的情況概述[J]．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（1）：46-49．

[4] 佟巍，喬紅偉，魏強(qiáng)，等．淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒在實(shí)驗(yàn)大鼠中的感染狀況[J]．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2010，27（4）：46-48．

[5] Zapata J C，Pauza C D，Djavani MM，et al．Lymphocytic choriomeningitis virus（LCMV）infection of macaques：a model for Lassa fever[J]．Antiviral Res，2011，92（2）：125-138．

[6] Oldstone M B．Biology and pathogenesis of lymphocytic choriomeningitis virus infection[J]．Curr Top Microbiol Immunol，2002，263：83-117．

[7] 邢進(jìn)，肖鏡，王吉，等．套式PCR檢測淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）方法應(yīng)用[J]．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2008，25（5）：53-55．

[8] 周娉，董偉，劉建高，等．湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中幾種常見的人獸共患病監(jiān)測[J]．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（3）：74-75．

[9] 邢進(jìn)，衛(wèi)禮，鞏薇，等．淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用[J]．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，2006，23（3）：5-8．

[10] Takimoto K，Taharaguchi M，Morikawa S，et al．Detection of the antibody to lymphocytic choriomeningitis virus in sera of laboratory rodents infected with viruses of laboratory and newly isolated strains by ELISA using purified recombinant nucleoprotein[J]．Exp Anim，2008，57（4）：357-365．

[11] 孫曉智，石鑫，吳紹強(qiáng)．熒光定量PCR技術(shù)及其在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用[J]．中國動(dòng)物檢疫，2006，23（12）：46-48．

[12] 石麗瑞，李秀華，韓惠瑛，等．布魯氏菌實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測體系的建立及應(yīng)用[J]．中國動(dòng)物檢疫，2014，31（2）：71-76．

Establishment of Nucleic Acid Assays for Rapid Detection of Lymphocytic Choriomeningitis Virus

Xiong Wei1，Lin Yingzheng1，Wei Xiaofeng2，Wang Yan1，Zhang Qiang1，Li Jian1，Hu Jianhua2，Huang Zhongrong1
（1. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135；2. Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203）

In order to survey and conduct epidemiological investigation of lymphocytic choriomeningitis virus（LCMV）among wild and experimental rodent animals，RT-PCR assay and Real-time RT-PCR assay were established using TaqMan probe for LCMV with high sensitivity，specificity and stability for rapid detection of LCMV.

lymphocytic chorimeningtis virus，RT-PCR，real-time RT-PCR，TaqMan probe

S852.659.5；S858.299

A

1005-944X（2015）04-0075-04

上海市科委科研項(xiàng)目（編號13DZ0502500）