金釵石斛生物堿對(duì)mcf－7細(xì)胞線粒體凋亡通路研究

安 欣，任建武*，李虹陽(yáng)，張秀海，石玉杰

(1.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083;2.北京市農(nóng)林科學(xué)研究院 生物技術(shù)中心，北京 100097;3.北京大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，北京 100191)

金釵石斛是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，在提高人體免疫能力［1］、抗衰老［2］、改善肝功能［3］、抑制腫瘤［4］、調(diào)血脂［5］等各方面有顯著的效果，在民間有“救命仙草”之美稱(chēng)?，F(xiàn)代研究表明，金釵石斛含有生物堿、多糖、聯(lián)芐、芴酮、菲、倍半萜、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種類(lèi)型的化學(xué)成分［6-14］。生物堿是其主要的有效成分，具有抗白內(nèi)障［15］、降血糖、減輕肝臟脂肪變性、改善記憶減退、改善胃腸道運(yùn)動(dòng)等藥理作用［16-19］，還具有明顯的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)功能［20］。

細(xì)胞凋亡是通過(guò)激活特定的蛋白酶——半胱天冬酶(caspase)來(lái)介導(dǎo)的。caspase是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)器，它可以和許多底物起作用，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞發(fā)生特有的生化和形態(tài)學(xué)改變，包括線粒體外膜通透性的改變等。在大多數(shù)細(xì)胞凋亡途徑中，線粒體起著起始、放大的中樞調(diào)控作用，各種線粒體死亡通路的反饋循環(huán)和交叉使線粒體成為凋亡通路的最重要的部件［21］。

許多生物堿在殺死腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中，往往同時(shí)殺死機(jī)體健康生長(zhǎng)的細(xì)胞，伴隨機(jī)體免疫力下降，最終導(dǎo)致整個(gè)人的死亡。對(duì)于石斛而言，基于特定的結(jié)構(gòu)和藥理作用，金釵石斛中的生物堿可以被用于治療腫瘤;且金釵石斛中含有大量的植物多糖，這種多糖可以提高機(jī)體免疫能力［22］。因此，金釵石斛可以實(shí)現(xiàn)固本與祛邪兼得。本文將對(duì)金釵石斛中生物堿誘導(dǎo)mcf-7細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究，并從線粒體凋亡途徑中進(jìn)一步探究凋亡機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

無(wú)菌超凈生物安全柜、立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋、細(xì)胞培養(yǎng)箱(BC-J80S)、BD流式細(xì)胞儀(BD Vantage SE)、顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、水浴鍋、低溫高速離心機(jī)、電泳儀、confocal熒光顯微鏡(XSP-63XDV)、漩渦震蕩器等。

1.2 試驗(yàn)材料

金釵石斛生物堿(成都普斯生物科技有限公司)、mcf-7細(xì)胞(購(gòu)于北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)中心)、Annexin V-FITC/PI試劑盒、JC-1試劑盒、0.25%胰酶、胎牛血清、雙抗溶液、1640培養(yǎng)基、MTT、DMSO(二甲基亞砜)、Trion-x100、RNA酶、蛋白全細(xì)胞裂解液、2×反應(yīng)液、6×蛋白 Loading Buffer、分子標(biāo)記 Marker、NC膜(0.45 nm 15×25 cm)、一抗體、二抗體、PAGE 4.22 ×10－12μmol/L 聚丙烯酰胺溶液、Tris鹽酸 8.8、Tris鹽酸6.8、APS過(guò)硫酸銨溶液、ECL顯色液等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 首先將凍存的細(xì)胞快速融化至37℃，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇。將0.25%胰酶消化后的細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和1%雙抗溶液的1640培養(yǎng)基(使用前37℃水浴鍋預(yù)熱)中，分裝到培養(yǎng)瓶中在37℃ 5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。24 h換一次細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞傳代，傳代比例為1∶3，細(xì)胞培養(yǎng)3代以后，待細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，細(xì)胞形態(tài)最佳，生長(zhǎng)代謝狀態(tài)最活躍，即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔100 μL接種于96孔板中，并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，放置于37℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，直至細(xì)胞貼壁。設(shè)計(jì)分組，各組分別加入不同濃度梯度的生物堿溶液0.1，0.15，0.2，0.25 mg/mL，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL。細(xì)胞于培養(yǎng)箱中37 ℃ 5%CO2孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。細(xì)胞板中每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即1.21×10-14μmol/L)，于37℃ 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h。震蕩離心，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩溶解10 min，在490 nm處檢測(cè)吸光值大小。實(shí)驗(yàn)鋪板要設(shè)計(jì)調(diào)零空白孔(培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)和對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。根據(jù)測(cè)得的吸光度值(OD值)，來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。取每組5個(gè)復(fù)孔OD值的平均值，制作柱狀圖進(jìn)行分析。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 mcf-7細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞2～3 min，加入3×10－16μmol/L的BSA防止過(guò)度消化細(xì)胞，離心收集消化后的細(xì)胞。預(yù)冷的PBS(4℃)輕輕重懸細(xì)胞一次，離心收集細(xì)胞。用1×Binding buffer 400 μL重懸細(xì)胞，向細(xì)胞懸液中加入5 μL的AV-FITC溶液，混勻避光，室溫孵育15 min。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)上機(jī)檢測(cè)前5 min，在細(xì)胞懸液中加入200 μL的1×binding buffer和5 μL PI溶液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別為藥物濃度為0.1，0.2，0.25 mg/mL 3種梯度濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組分為空白對(duì)照組、AV-FITC單染色對(duì)照組、PI單染色對(duì)照組。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)上機(jī)需要有一定的順序，按著AV-FITC對(duì)照組、PI對(duì)照組、空白對(duì)照組的順序上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 取1管細(xì)胞濃度大于1×106的細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的1×PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，離心并棄掉上清液。以0.5 mL 1×PBS重懸細(xì)胞，迅速打入3.5 mL 1.52×10－11μmol/L預(yù)冷的乙醇中，吹打均勻，4℃儲(chǔ)存過(guò)夜。離心固定過(guò)夜的細(xì)胞，棄掉上層乙醇液體，用1×PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次。用含有2 mg RNase A的10 μL PI/Triton X-100染色液重懸細(xì)胞，37℃染色15 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)mcf-7細(xì)胞周期的阻滯周期并分析。

1.3.5 Confocal(熒光共聚焦顯微鏡)觀察細(xì)胞線粒體去極化現(xiàn)象 生長(zhǎng)狀態(tài)良好的mcf-7細(xì)胞經(jīng)過(guò)不含有EDTA的胰酶消化后，制備成細(xì)胞濃度為1×106的細(xì)胞懸液，鋪板于直徑5 cm的Confocal細(xì)胞專(zhuān)用板中，加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。24 h后，棄掉培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次。設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在對(duì)照組中加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中分別加入0.125%，0.25%，0.5%的生物堿溶液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出細(xì)胞板，棄掉含有生物堿的培養(yǎng)液。在實(shí)驗(yàn)組和空白組的細(xì)胞板中邊震蕩邊加入1 mL終濃度為3.83*10－18μmol/L的JC-1溶液，避光孵育30 min，進(jìn)行線粒體染色。染色過(guò)后用PBS輕輕洗滌細(xì)胞3～5次。吸走PBS洗滌液，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，Confocal上鏡觀察細(xì)胞線粒體膜電位變化。

1.3.6 Westernblot(免疫印跡法)caspase-3蛋白表達(dá) 配置12%10 mL的分離膠和5%4 mL的濃縮膠，混勻后灌膠，封膠。將細(xì)胞酶解消化并收集，制備細(xì)胞濃度大于1×106的細(xì)胞懸液。用PBS洗滌細(xì)胞1次，吸盡上清液后，按照200萬(wàn)細(xì)胞加入50 μL的比例加入全細(xì)胞裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解30 min。裂解過(guò)程中，渦旋震蕩3～4次，每次10 s。裂解完畢后，細(xì)胞4℃離心20 min。吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，放置冰上待用。

分別吸取10 μL預(yù)染低分子量蛋白質(zhì)和加入marker的蛋白裂解液，依次注入泳道內(nèi)。電泳2 h。在濕法轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，恒定電流400 mA，轉(zhuǎn)膜4 h。將膜從電轉(zhuǎn)夾中取出，用去離子水和PBST洗滌NC膜3次，每次5 min。漂洗過(guò)后的NC膜放置于封閉液中，緩慢搖晃封閉1 h。

把經(jīng)過(guò)封閉的NC膜與按照1∶500(檢測(cè)全長(zhǎng)caspase-3)/1∶250(檢測(cè)被剪切的cleaved caspase-3)混合稀釋好的小鼠單克隆抗體4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。一抗孵育過(guò)后，用PBST洗滌NC膜3次，每次10 min。結(jié)合二抗體按照1∶1 000的比例稀釋辣根過(guò)氧化物酶，在雜交袋里室溫孵育2 h，洗滌NC膜3次，每次10 min。ECL顯色檢測(cè)，并分別曝光全長(zhǎng)caspase-3和被剪切的cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)量，顯影沖洗。

2 結(jié)果與討論

2.1 MTT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

結(jié)果顯示，不同濃度的金釵石斛生物堿對(duì)mcf-7細(xì)胞作用，隨著濃度的增大細(xì)胞增殖活力受到抑制，細(xì)胞活力明顯下降。濃度越大，細(xì)胞活力越差，抑制越明顯，有依賴(lài)劑量效應(yīng)。生物堿濃度為0.1%時(shí)對(duì)細(xì)胞活力影響較明顯，0.25%為最大效應(yīng)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖中，A圖為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，沒(méi)有進(jìn)行誘導(dǎo)的mcf-7細(xì)胞存活率較好，早期凋亡率為0.4%，中晚期凋亡率為0.11%(表1)，具有可參考對(duì)照價(jià)值。圖B為濃度0.1%的生物堿誘導(dǎo)mcf-7細(xì)胞，24 h后細(xì)胞發(fā)生早期凋亡率為11.54%，中晚期凋亡率為 5.48%。圖 C為濃度0.2%的生物堿誘導(dǎo)mcf-7細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24 h后細(xì)胞的早期凋亡率為18.69%，中晚期凋亡率為15.58%。圖D中的細(xì)胞早期凋亡率達(dá)到26.98%，接近30%，中晚期凋亡率為42.43%，已經(jīng)接近50%，促使細(xì)胞中晚期凋亡率達(dá)到一半的生物堿濃度為0.25%。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞總體凋亡率分別為17.02%，34.27%，69.41%。隨著生物堿濃度的增大，細(xì)胞總體凋亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，接近70%。mcf-7細(xì)胞對(duì)金釵石斛生物堿有劑量效應(yīng)關(guān)系，顯示出促進(jìn)凋亡效應(yīng)。表明生物堿可顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖1 不同濃度生物堿對(duì)mcf-7細(xì)胞抑制增殖作用Fig.1 The inhibitory effect of dendrobine of different concentration on mcf-7 cells

表1 流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)檢測(cè)mcf-7細(xì)胞凋亡率Tab.1 The apoptosis rate of mcf-7 with flow cytometry

圖2 流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)檢測(cè)mcf-7細(xì)胞凋亡率Fig.2 The apoptosis rate of mcf-7 with flow cytometry

2.3 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

結(jié)果顯示，金釵石斛生物堿抑制mcf-7腫瘤細(xì)胞的增殖是通過(guò)抑制細(xì)胞周期來(lái)實(shí)現(xiàn)的。隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞周期G0/G1期比例增加，說(shuō)明金釵石斛生物堿對(duì)mcf-7細(xì)胞增殖的抑制作用途徑為阻滯細(xì)胞G0/G1期。在G0/G1期是細(xì)胞復(fù)制的重要時(shí)期，細(xì)胞的RNA，如mRNA、tRNA、rRNA，蛋白和糖原的合成等。可見(jiàn)，金釵石斛生物堿作用mcf-7細(xì)胞抑制其腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)增，在G0/G1期起到了良好的抑制作用，mcf-7細(xì)胞對(duì)生物堿有依賴(lài)作用，濃度越大，抑制效果越好。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)mcf-7細(xì)胞周期Fig.3 The cell cycle of mcf-7 with flow cytometry

2.4 Confocal(熒光共聚焦顯微鏡)觀察細(xì)胞線粒體去極化現(xiàn)象

金釵石斛生物堿誘導(dǎo)mcf-7細(xì)胞凋亡24 h，凋亡發(fā)生過(guò)程中，線粒體膜電位去極化的過(guò)程出現(xiàn)，如圖4可見(jiàn)，細(xì)胞線粒體膜電位的改變引起染色紅綠比例逐漸減小，隨著不同濃度金釵石斛生物堿的作用，濃度越大，去極化現(xiàn)象越明顯，mcf-7細(xì)胞發(fā)生早期凋亡越明顯?？梢?jiàn)，線粒體膜去極化現(xiàn)象的發(fā)生是細(xì)胞凋亡的早期表現(xiàn)，一旦線粒體膜電位損耗，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程。抑制線粒體膜電位去極化現(xiàn)象的發(fā)生，就會(huì)阻抑細(xì)胞凋亡的發(fā)生，說(shuō)明線粒體膜電位去極化現(xiàn)象為凋亡的特征性改變。經(jīng)對(duì)金釵石斛生物堿誘導(dǎo)凋亡后的mcf-7細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)也表明，線粒體膜電位的去極化現(xiàn)象要早于胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，早于凋亡時(shí)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變、蛋白酶caspase-3激活等變化，提示線粒體膜電位下降是凋亡早期階段。

圖4 JC-1細(xì)胞線粒體染色去極化現(xiàn)象Fig.4 The mitochondrial depolarization of mcf-7

2.5 Westernbolt(免疫印跡法)caspase-3蛋白表達(dá)

Mcf-7細(xì)胞經(jīng)過(guò)金釵石斛生物堿的誘導(dǎo)，24 h后，細(xì)胞發(fā)生早期凋亡現(xiàn)象。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行westernblot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了procaspase-3的蛋白表達(dá)條帶——cleaved-caspase-3的清晰條帶。細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生，是由于線粒體去極化導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，一些可溶性蛋白會(huì)釋放到細(xì)胞漿中，細(xì)胞色素C為信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的激活因子，激活以酶原形式存在的procaspase-3、caspase-3為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行分子，故啟動(dòng)了細(xì)胞死亡程序［23-26］。如圖5所示，對(duì)細(xì)胞全蛋白液體進(jìn)行檢測(cè)，不同濃度稀釋caspase-3抗體，分別檢測(cè)全長(zhǎng)caspase-3和被剪切的17 ku的cleaved caspase-3。圖中32 ku的procaspase-3蛋白表達(dá)量條帶清晰可見(jiàn)，不同濃度的金釵石斛生物堿誘導(dǎo)mcf-7細(xì)胞，隨著濃度的增加細(xì)胞中32 ku沒(méi)有被激活的凋亡執(zhí)行基因蛋白表達(dá)量會(huì)減少。作用時(shí)間相同(24 h)的條件下，濃度越大，細(xì)胞的早期凋亡事件發(fā)生的越明顯，mcf-7細(xì)胞中全細(xì)胞蛋白液檢測(cè)到被剪切的17 ku大小的caspase-3基因蛋白表達(dá)條帶，蛋白條帶完整可見(jiàn)，生物堿濃度的增加使得procaspase-3激活，剪切底物為17 ku caspase-3基因蛋白表達(dá)條帶。金釵石斛生物堿可使mcf-7細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，且凋亡機(jī)制進(jìn)一步確認(rèn)為線粒體內(nèi)通路機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞最終死亡。

圖5 不同濃度生物堿處理mcf-7細(xì)胞24 h對(duì)caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The expression lever of caspase-3 on mcf-7 cells

3 結(jié)論與展望

金釵石斛生物堿對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，且具有明顯的促凋亡效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示金釵石斛生物堿能使mcf-7細(xì)胞通過(guò)線粒體途徑發(fā)生細(xì)胞凋亡，且有細(xì)胞色素C釋放，并激活procaspase-3啟動(dòng)了細(xì)胞的死亡程序。

對(duì)于金釵石斛生物堿的抗腫瘤作用，可以進(jìn)一步聯(lián)合石斛多糖的抗氧化和提高機(jī)體免疫力效應(yīng)，通過(guò)對(duì)健康機(jī)體細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞聯(lián)合作用，進(jìn)行對(duì)比研究，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)抗癌治療中對(duì)機(jī)體免疫力的傷害。

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