一株酵母菌的鑒定及其揮發(fā)性物質(zhì)防病測(cè)定

黃 蓉，黃 盼，黃瑞榮，李國(guó)慶*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，江西 南昌 330200;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 湖北省作物病害監(jiān)測(cè)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

草莓灰霉病是草莓大棚生產(chǎn)中及采后草莓儲(chǔ)藏期的重要病害之一，也是導(dǎo)致草莓的產(chǎn)量和質(zhì)量降低的主要因素之一［1］。大棚草莓發(fā)生灰霉病后，每年能造成10% ～30%的減產(chǎn)，在雨水較多的年份則可能達(dá)到50%以上的減產(chǎn)［2］，并且灰霉病在草莓整個(gè)生長(zhǎng)期和草莓果實(shí)儲(chǔ)藏期，均能引發(fā)危害。目前對(duì)草莓灰霉病的防治主要還是依靠噴灑殺菌劑、溫濕調(diào)控度和清除病殘?bào)w。而長(zhǎng)期使用殺菌劑導(dǎo)致的灰葡萄孢產(chǎn)生抗藥性及殘留等問(wèn)題，已引起大眾關(guān)注，包括生物防治在內(nèi)的替代防治技術(shù)迫切需要發(fā)展［3］。

酵母菌因?yàn)槠渌哂械呢S富的酶系和多種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的生理生化活性物質(zhì)，而廣泛地應(yīng)用于人們的生活中。而作為生防菌，酵母菌的優(yōu)勢(shì)也很明顯。除了用途廣泛、容易獲得外，酵母菌的適應(yīng)力強(qiáng)、繁殖快，對(duì)環(huán)境的要求不高，抗逆能力強(qiáng)，生產(chǎn)工藝及流程已較為成熟。一些酵母菌還可以和其他的殺菌劑合用，從而提高對(duì)病害的控制作用，降低殺菌劑的使用劑量［4］。因此酵母菌近年來(lái)越來(lái)越受重視。

對(duì)于酵母菌的分類(lèi)鑒定，傳統(tǒng)的方法主要是通過(guò)形態(tài)特征的觀察和生理生化特性的測(cè)定。隨著分子生物學(xué)和現(xiàn)代微生物分類(lèi)學(xué)的不斷發(fā)展，從遺傳進(jìn)化等角度解決微生物種群之間和種內(nèi)存在的相互關(guān)系問(wèn)題，也是客觀的需求，因而，分子生物學(xué)的方法也被廣泛地應(yīng)用于酵母菌的分類(lèi)鑒定上。

至今已有不少研究人員展開(kāi)了對(duì)于酵母菌作為生防菌的控制機(jī)理的研究。若植物上的酵母菌數(shù)量的變化，即濃度的變化會(huì)影響酵母菌的生控作用，則說(shuō)明酵母菌與別的病原菌間存在營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)［5］。若與此同時(shí)引起了植物體內(nèi)某些酶的產(chǎn)生或是量的變化而控制病害的發(fā)生，則說(shuō)明酵母菌誘發(fā)了植物自身抗性［6］。前期研究發(fā)現(xiàn)酵母菌可以不接觸植物組織，通過(guò)產(chǎn)生抑菌性揮發(fā)性物質(zhì)這一方式來(lái)控制病害［7-8］。因此，釋放揮發(fā)性抑菌物質(zhì)也成為酵母菌的防病機(jī)理之一，且這一機(jī)制具有巨大的應(yīng)用空間。目前已有可產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的真菌被開(kāi)發(fā)為生物殺菌劑來(lái)防治植物病害。如植物內(nèi)生真菌Muscodor albus菌株CZ-620已被作為生物殺菌劑來(lái)防治水果收獲后儲(chǔ)藏期病害、甜菜苗期病害、胡椒根腐病、茄子枯萎病、植物線(xiàn)蟲(chóng)病害和建筑物腐霉［9-15］等。

本文針對(duì)前期工作中篩選得到的一株從草莓植株上分離得到的酵母菌菌株W4682來(lái)進(jìn)行探討。明確其分類(lèi)地位，并測(cè)定其揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰霉病的抑制能力，為以后生產(chǎn)應(yīng)用工作的開(kāi)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

從不同地區(qū)采集回來(lái)的草莓植株樣品中共分離得到1151株酵母菌菌株，經(jīng)過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)測(cè)定和離體葉片及果實(shí)菌體接種測(cè)定的層層篩選，獲得菌株W4682可以有效防治草莓灰霉病的酵母菌菌株?；移咸焰?Botrytis cinerea)菌株STBC-1分離自罹病草莓果實(shí)。

1.2 ITS-5.8S rDNA 序列分析

采用CTAB法提取酵母菌總DNA，于PDA平板上20℃進(jìn)行菌株活化，3 d后將新鮮菌體涂布到鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上培養(yǎng)，2 d后用少量無(wú)菌水從PDA培養(yǎng)基上將新鮮的酵母菌菌體洗下，裝在離心管中，放在離心機(jī)中以10 000 r/min的速度離心1 min，收集的菌體放入已預(yù)冷的研缽中，將液氮倒入研缽中，使菌細(xì)胞冷凍，同時(shí)迅速研磨酵母菌的菌體，使之成為粉末狀。提取DNA的方法參照文獻(xiàn)［16］。采用50 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物ITS1/ITS4的設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)［17］，PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)［18］。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)(110 V，1 h)擴(kuò)增產(chǎn)物大小。使用回收試劑盒 AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit(Axygen Scientific，Inc.Union City，USA)對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化后，將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(TaKaRa Biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China)上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coli DH5α)細(xì)胞。挑選陽(yáng)性克隆送往北京賽諾生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)得的基因序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中通過(guò)BLAST程序進(jìn)行對(duì)比分析。

1.3 形態(tài)及生物學(xué)鑒定

分子測(cè)序比對(duì)的結(jié)果與幾個(gè)種的相似度都很高，因而按照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》中所描述方法分別進(jìn)行單菌落單細(xì)胞特征觀察試驗(yàn)，假菌絲形成試驗(yàn)，子囊孢子誘導(dǎo)試驗(yàn)，糖發(fā)酵測(cè)定，碳源、氮源和醇類(lèi)同化試驗(yàn)，產(chǎn)生類(lèi)淀粉化合物測(cè)定，高滲透壓培養(yǎng)測(cè)定，產(chǎn)酸、產(chǎn)酯測(cè)定，尿素水解試驗(yàn)，缺素生長(zhǎng)測(cè)定和生長(zhǎng)溫度測(cè)定等試驗(yàn)［19］，對(duì)菌株分類(lèi)地位加以確認(rèn)。

1.4 酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制測(cè)定

采用雙皿對(duì)扣法［7］測(cè)定菌株W4682生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性成分對(duì)灰葡萄孢生長(zhǎng)的影響。將100 μL菌株W4682懸液(108cells/mL)均勻涂布在YEPDA平板(酵母提取浸粉10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 6.0左右)上。1 d后，在另外的PDA平板中央接種直徑為6 mm的灰葡萄孢菌絲塊。將2個(gè)培養(yǎng)皿蓋去掉，皿底口對(duì)口扣在一起，YEPDA平板在下，PDA平板在上，用封口膜封口。在對(duì)照處理中，對(duì)扣皿中的YEPDA平板沒(méi)有接種菌株W4682，而PDA平板上仍然接種灰葡萄孢菌絲塊。將2種處理的對(duì)扣皿置于20℃下培養(yǎng)3 d，測(cè)量灰葡萄孢菌落直徑。各處理設(shè)3次重復(fù)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)儲(chǔ)藏期草莓灰霉病的防治

將100 μL新鮮酵母細(xì)胞懸浮液(108cells/mL)涂布在YEPDA平板上，20℃下培養(yǎng)1 d，用無(wú)菌水將平板上的酵母菌體洗下，血球計(jì)數(shù)板計(jì)算每皿生物量。用75%的乙醇對(duì)試驗(yàn)用的干燥器和草莓進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水洗滌。在6個(gè)干燥器底部依次放入培養(yǎng)1 d的酵母菌株W4682平板0，2，4，6，8，10個(gè)，分別記為處理CK，W2，W4，W6，W8，W10，另外取一個(gè)干燥器，在干燥器底部先鋪一定量的活性炭，然后將另外的10個(gè)平板置于活性炭上，記為處理WAC。蓋上隔板，將晾干后的草莓置于隔板上，14顆果每板，每果接種100 μL灰霉菌孢子懸浮液(106cells/mL)，加蓋密封，20℃下培養(yǎng)7 d后，記錄發(fā)病率及發(fā)病程度。病級(jí)嚴(yán)重度劃分參照文獻(xiàn)［7］。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 酵母菌定殖草莓果實(shí)產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓灰霉病的防治

將20顆草莓進(jìn)行表面消毒后浸泡在新鮮酵母細(xì)胞懸浮液(108cells/mL)中5 s，取出后晾干，置于消毒的干燥器底部，加蓋密封，20℃下培養(yǎng)1 d后，將另外20顆草莓進(jìn)行表面消毒后，直接放于另一消毒的干燥器底部，在2個(gè)干燥器隔板上分別放置14顆新鮮草莓，加蓋密封，20℃下培養(yǎng)。同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照處理，即僅在干燥器隔板上放置14顆草莓，底部不做任何添加。7 d后記錄發(fā)病率和發(fā)病程度。病級(jí)嚴(yán)重度劃分同上。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用 SAS 軟件(SAS Institute，Version 8.0，Cary，NC，USA，1999)中的方差分析(ANOVA)程序和 Duncan氏新復(fù)極差法分析各試驗(yàn)中不同處理之間的差異。用t測(cè)驗(yàn)比較2種處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS-5.8S rDNA 序列分析

擴(kuò)增后獲得酵母菌菌株W4682的ITS-5.8S rDNA片段大小均為618 bp，經(jīng)過(guò)使用BLAST程序?qū)@得的序列與在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)上傳注冊(cè)的ITS-5.8S rDNA序列進(jìn)行同源比對(duì)分析后，證實(shí)該菌株與Debaryomyces hansenii、Candida saitoana、Candida glaebosa和Filobasidiella neoformans這幾個(gè)種的相似度都很高。將所獲序列提交GenBank，登錄號(hào)為GQ913348。

圖1 菌株W4682產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰霉菌絲生長(zhǎng)的抑制效果(20℃，3 d)Fig.1 Effect of the volatile organic compounds produced by the strain W4682 on mycelial growth of B.cinerea(20 ℃，3 d)

2.2 形態(tài)及生物學(xué)鑒定

將形態(tài)及生物學(xué)測(cè)定的結(jié)果對(duì)照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》里的酵母菌檢索表進(jìn)行檢索［19］，菌株W4682可發(fā)酵D-葡萄糖，可同化赤蘚糖醇生長(zhǎng)，不可同化硝酸鹽生長(zhǎng)，可同化蔗糖生長(zhǎng)，不可同化L-鼠李糖生長(zhǎng)，可同化棉子糖生長(zhǎng)，可同化蜜二糖生長(zhǎng)，不可同化D-阿拉伯糖生長(zhǎng)，不可同化乳糖生長(zhǎng)，無(wú)生物素時(shí)可生長(zhǎng)，不可同化淀粉生長(zhǎng)，0.01%放線(xiàn)菌酮條件下不生長(zhǎng)，形成假菌絲不產(chǎn)生有隔菌絲。因此，酵母菌菌株W4682應(yīng)為:子囊菌門(mén)(Ascomycota)、半子囊菌綱(Hemiascomycetes)、酵母菌目(Saccharomycetales)、酵母菌科(Saccharomycetaceae)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、漢遜德巴利酵母Debaryomyces hansenii。

2.3 酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制

在接種灰葡萄孢和菌株W4682的對(duì)扣皿處理中，3 d后PDA平板上的灰葡萄孢菌落直徑為1.7 cm，而在僅接種灰葡萄孢的對(duì)扣處理中，灰葡萄孢直徑達(dá)到8.5 cm。2種處理之間灰葡萄孢菌落直徑差異性達(dá)到極顯著水平(圖1)。在接種灰葡萄孢和菌株W4682的對(duì)扣皿處理中，2種真菌在空間上是分離的，灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)受到抑制說(shuō)明菌株W4682在生長(zhǎng)時(shí)利用YEPDA中的養(yǎng)分產(chǎn)生了揮發(fā)性抗真菌物質(zhì)。

2.4 酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)儲(chǔ)藏期草莓灰霉病的防治

干燥器中每皿的酵母菌生物量約為1010cells，因此處理CK，W2，W4，W6，W8，W10中酵母菌的生物量呈梯度上升，處理WAC中酵母菌的生物量與處理W10相同。如圖2所示，CK發(fā)病最為嚴(yán)重，果實(shí)的平均發(fā)病嚴(yán)重度為7.4，平均發(fā)病率為100.0%，菌絲布滿(mǎn)草莓。W2，W4，W6，W8，W10的發(fā)病程度則依次減輕。W2處理中草莓果實(shí)的平均發(fā)病嚴(yán)重度為5.8，平均發(fā)病率為100.0%;W4處理中草莓果實(shí)的平均發(fā)病嚴(yán)重度為3.7，平均發(fā)病率為71.4%;W6處理中草莓果實(shí)的平均發(fā)病嚴(yán)重度為1.1，平均發(fā)病率為57.1%;W8處理中草莓果實(shí)的平均發(fā)病嚴(yán)重度為0.3，平均發(fā)病率為28.6%;W10處理中草莓果實(shí)的平均病害嚴(yán)重度為0.2，平均發(fā)病率為21.4%。由此可見(jiàn)，草莓的發(fā)病程度與酵母菌的生物量是呈負(fù)相關(guān)的。而在WAC處理中草莓果實(shí)平均嚴(yán)重度恢復(fù)至6.7，平均發(fā)病率上升至100.0%，與CK處理的結(jié)果間沒(méi)有顯著差異。由此說(shuō)明干燥器底部的酵母菌體可以釋放出揮發(fā)性抑菌物質(zhì)，使發(fā)病程度降低，而添加的活性炭可以將這些揮發(fā)性物質(zhì)吸附，減少其對(duì)灰霉菌侵染草莓的影響。

圖2 菌株W4682產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)儲(chǔ)藏期草莓灰霉病的防治效果Fig.2 Effect of the volatile organic compounds produced by the strain W4682 on suppression of botrytis fruit rot of strawberry

酵母菌定殖草莓果實(shí)產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓灰霉病的防治效果Effect of the volatile organic compounds from yeast-infested fruits of strawberry on suppression of botrytis fruit rot of strawberry

2.5 酵母菌定殖草莓果實(shí)產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓灰霉病的防治

從圖3和圖4的結(jié)果中可知，當(dāng)干燥器底部為空白時(shí)，隔板上放置的草莓果實(shí)其平均發(fā)病率為100.0%，平均病情嚴(yán)重度為7.6(T1);當(dāng)干燥器底部為未接酵母菌的草莓果實(shí)時(shí)，隔板上放置的草莓果實(shí)的平均發(fā)病率為97.6%，平均病情嚴(yán)重度為6.0(T2)，底部的草莓果實(shí)平均發(fā)病率為100.0%，平均病情嚴(yán)重度為7.7(T3);而當(dāng)干燥器底部為接種酵母菌W4682的草莓果實(shí)時(shí)，隔板上放置的草莓果實(shí)平均發(fā)病率僅為21.4%，平均病情嚴(yán)重度為0.8(T4)，且底部的草莓果實(shí)平均發(fā)病率也僅為35.0%，平均病情嚴(yán)重度為1.2(T5)。很明顯未接種酵母菌的草莓無(wú)法抑制草莓灰霉病發(fā)生，而草莓接種了酵母菌W4682后不僅可以控制被接種果實(shí)的病害發(fā)生，還可以產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)，控制隔板上未接種酵母菌的草莓上病害的發(fā)生。

圖4 酵母菌定殖草莓果實(shí)產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓灰霉病的防治效果Fig.4 Effect of the volatile organic compounds from yeast-infested fruits of strawberry on suppression of botrytis fruit rot of strawberry

3 結(jié)論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)ITS-5.8S rDNA結(jié)構(gòu)既具保守性(反映生物物種的親緣關(guān)系)，又具高變性(揭示生物物種的特征核酸序列)［20］。測(cè)定ITS-5.8S rDNA的序列已經(jīng)被作為酵母菌鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化研究的重要手段，測(cè)定的結(jié)果也已成為研究酵母菌分類(lèi)的必要數(shù)據(jù)。但在某些情況下，單獨(dú)使用ITS-5.8S rDNA的序列測(cè)定是無(wú)法確定其分類(lèi)地位的。只有同時(shí)采用傳統(tǒng)的形態(tài)特征和生物學(xué)特性的分類(lèi)鑒定法［21］，才能確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，更客觀地反映菌株的實(shí)際分類(lèi)地位，得到更為可靠的結(jié)果。因而經(jīng)形態(tài)學(xué)、生物學(xué)及ITS測(cè)定后，鑒定菌株W4682為漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)。目前報(bào)道的漢遜德巴利酵母防病機(jī)制主要包括競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性［22-23］，本文中證實(shí)了漢遜德巴利酵母菌株W4682產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)同樣對(duì)灰霉菌的生長(zhǎng)及灰霉病的發(fā)生都有較好的抑制作用，是其主要防病機(jī)理之一。這是首次報(bào)道漢遜德巴利酵母產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)有抑菌效果和防病能力。

漢遜德巴利酵母菌株W4682接種草莓后不僅可以在被接種果實(shí)上定殖，控制其病害發(fā)生，還可以產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)，控制同一密閉空間內(nèi)未接種的草莓上病害的發(fā)生。因此，在獲得相同防病效果的前提下，可以使酵母菌在田間和儲(chǔ)藏期的應(yīng)用更為方便，使生防酵母菌的實(shí)際施用劑量降低，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供了有利的條件。據(jù)報(bào)道，漢遜德巴利酵母可以防治芒果炭疽病和蒂腐病，甜櫻桃褐腐病，桃軟腐病，蘋(píng)果青霉病，柑桔綠霉病、青霉病和酸腐病等儲(chǔ)藏期病害［22，24-27］。但本研究中沒(méi)有測(cè)定菌株W4682產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)其它果實(shí)致腐真菌的防治效果，為了開(kāi)發(fā)應(yīng)用工作的展開(kāi)，其防病廣譜性的測(cè)定，需要進(jìn)一步研究探討。雖然本研究中所用的漢遜德巴利酵母菌株分離于健康的草莓葉片組織，且漢遜德巴利酵母是干酪中最常見(jiàn)的酵母菌之一，對(duì)干酪的成熟起著重要的作用［28］，其相關(guān)研究屢見(jiàn)不鮮，但也有報(bào)道稱(chēng)其是人類(lèi)條件致病菌［29］，因此分析驗(yàn)證菌株W4682產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)組分以及檢測(cè)好菌株本身的安全性問(wèn)題，都是下一步工作必須要解決的重點(diǎn)。

［1］Jarvis W R.The Biology of Botrytis［M］.London:Academic Press，1980:1-17.

［2］羅軍.金華市金東區(qū)2種不同品種草莓灰霉病的發(fā)生情況調(diào)查［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15(23):124-129.

［3］葛紹榮，牛莉娜，李銘.番茄灰霉病害及其微生物防治的研究進(jìn)展［J］.生物加工過(guò)程，2007，5(3):15-19.

［4］Qin G Z，Tian S P.Biocontrol of postharvest diseases of jujube fruit by Cryptococcus laurentii，combined with a low dosage of fungicides under different storage conditions［J］.Plant Disease，2004，88(5):497-501.

［5］Pusey P L，Stockwell V O，Mazzola M.Epiphytic bacteria and yeasts on apple blossoms［J］.Biological Control，2009，99(5):571-581.

［6］Zhao Y，Tu K，Shao X F，et al.Effects of the yeast Pichia guilliermondii against Rhizopus nigricans on tomato fruit［J］.Postharvest Biology and Technology，2008，25(3):1018-1016.

［7］Huang R，Li G Q，Zhang J，et al.Control of postharvest Botrytis fruit rot of strawberry by volatile organic compounds of Candida intermedia［J］.Phytopathology，2011，101(7):859-869.

［8］Huang R，Che H J，Zhang J，et al.Evaluation of Sporidiobolus pararoseus strain YCXT3 as biocontrol agent of Botrytis cinerea on post-harvest strawberry fruits［J］.Biological Control，2012，62(1):53-63.

［9］Sch?ler C E G，Gürtler H，Petersen R，et al.Volatile metabolites from actinomycetes［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(9):2615-2621.

［10］Mercier J，Jiménez J I.Control of fungal decay of apples and peaches by the biofumigant fungus Muscodor albus［J］.Postharvest Biology and Technology，2004，31(1):1-8.

［11］Stinson A M，Zidack N K，Strobel G A，et al.Mycofumigation with Muscodor albus and Muscodor roseus for control of seedling diseases of sugar beet and Verticillium wilt of eggplant［J］.Plant Disease，2003，87(11):1349-1354.

［12］Mercier J，Manker D C.Biocontrol of soil-borne diseases and plant growth enhancement in greenhouse soilless mix by the volatile-producing fungus Muscodor albus［J］.Crop Protection，2005，24(4):355-362.

［13］Stinson M，Ezra D，Hess W M，et al.An endophytic Gliocladium sp.of Eucryphia cordifolia producing selective volatile antimicrobial compounds［J］.Plant Science，2003，165(4):913-922.

［14］Riga E，Lacey L A，Guerra N.Muscodor albus，a potential biocontrol agent against plant-parasitic nematodes of economically important vegetable crops in Washington State，USA［J］.Biological Control，2008，45(3):380-385.

［15］Mercier J，Jiménez J I.Potential of the volatile-producing fungus Muscodor albus for control of building molds［J］.Canadian Journal of Microbiology，2007，53(3):404-410.

［16］M?ller E M，Bahnweg G，Sandermann H，et al.A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi，fruit bodies，and infected plant tissues［J］.Nucleic Acids Research，1992，20(22):6115-6116.

［17］White T J，Bruns T，Lee S，et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［M］//Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al eds.PCR protocols:a guide to methods and applications.San Diego:Academic Press，1990:315-322.

［18］Staats M，Van Baarlen P，Van Kan J A L.Molecular phylogeny of the plant pathogenic genus Botrytis and the evolution of host specificity［J］.Molecular Biology and Evolution，2005，22(2):333-346.

［19］Barnett J A.酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)［M］.胡瑞卿，譯.青島:青島海洋大學(xué)出版社，1991:17-430.

［20］周春艷，張秀玲，王冠.酵母菌的 5 種鑒定方法［J］.中國(guó)釀造，2006，161(8):51-54.

［21］Harrigan W F.食品微生物實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)［M］.李衛(wèi)華等，譯.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2004:248-253.

［22］何秀娟.篩選芒果采后炭疽病和蒂腐病的生防菌研究［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［23］劉曉媛.拮抗酵母菌生防機(jī)理及應(yīng)用研究［D］.天津:天津科技大學(xué)，2009.

［24］范青，田世平，姜愛(ài)麗，等.采摘后果實(shí)病害生物防治拮抗菌的篩選和分離［J］.中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2001，21(4):313-316.

［25］Diesh S，Goutam M.Improved control of Rhizopus stolonifer-induced storage rot of peach with hot water and antagonistic yeast，Debaryomyces hansenii［J］.Indian Phytopathology，2012，59(2):168-173.

［26］Singh D，Sharma R R，Samuel D V，et al.Enhancing the bioefficacy of Debaryomyces hansenii with sodium salts for reducing the blue mould rot in apples［J］.Indian Phytopathology，2011，62(4):478-483.

［27］Chalutz E，Wilson C L.Postharvest biocontrol of green and blue mold and sour rot of citrus fruit by Debaryomyces hansenii［J］.Plant Disease，1990，74(2):134-137.

［28］Fadda M E，Mossa V，Pisano M B.Occurrence and characterization of yeasts isolated from artisanal Fiore Sardo cheese［J］.International Journal of Food Microbiology，2004，95(1):51-59.

［29］陳裕充，溫海.野生鴿作為勞倫梯隱球菌、單咽隱球菌及漢遜德巴利酵母菌的攜帶者［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):皮膚性病學(xué)分冊(cè)，2000，26(4):253-254.