抗腹瀉性貝毒軟海綿酸膠體金免疫快速檢測(cè)技術(shù)研究

胡樂琴，馬曉康，吳春燕

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院 ，上海 201306)

腹瀉性貝毒(diarrhetic shellfish poison，DSP)是危害比較嚴(yán)重的赤潮毒素之一，在世界廣泛存在［1-3］。DSP中導(dǎo)致腹瀉的主要成分是軟海綿酸(okadaicacid，OA)及其衍生物鰭藻毒素(dinophysistoxins，DTXs)，OA分布廣泛［4］、發(fā)病率高，對(duì)腸道、肝臟、神經(jīng)、胎盤等多種器官和組織具有致病性，引起的急性中毒癥狀為腹瀉、惡心、嘔吐及腸胃絞痛等［5－7］。要預(yù)防藻毒素的危害就必須有靈敏的檢測(cè)方法。免疫學(xué)技術(shù)具有快速、靈敏、操作簡單、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備、價(jià)格低廉、便于制成可攜帶的檢測(cè)紙板和試劑盒等優(yōu)點(diǎn)，成為藻毒素現(xiàn)場快速檢測(cè)的首選方法［8］。國際上已經(jīng)有關(guān)于免疫檢測(cè)技術(shù)在藻毒素檢測(cè)的研究報(bào)道［9］，并且已經(jīng)制備出了部分藻毒素的ELISA試劑盒，如美國、日本、歐洲一些國家有微囊藻毒素(microcystin)和軟海綿酸(okadaic acid，OA)的ELISA檢測(cè)試劑盒銷售［10］;近年我國也有學(xué)者研究藻毒素的免疫檢測(cè)技術(shù)，如劉仁沿［11］研究了OA的膠體金檢測(cè)、趙曉聯(lián)［12］研究了MCs的免疫檢測(cè)、盧士英［13］建立了OA的ELISA檢測(cè)等。我國目前已經(jīng)有自制的OA ELISA檢測(cè)試劑盒，但尚無OA膠體金檢測(cè)試紙板銷售。研制具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高質(zhì)量的藻毒素膠體金檢測(cè)試紙條，是我國藻類學(xué)者努力的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

軟海綿酸購自北京伊普瑞斯公司;單抗為實(shí)驗(yàn)室制備。其它試劑均購自上海生工。

1.2 OA-BSA 的制備

1.2.1 試劑配制 (1)將500 μg MC－LR(OA)溶于0.5 mL DMSO中，配制成1 mg/mL溶液;(2)配制交聯(lián)劑溶液:水溶性碳二亞胺－NHS液，濃度為10 μL純水中含EDC(水溶性碳二亞胺)50 μg和NHS(N － 羥基琥珀酰亞胺)30 μg及10 μL 純水中含 EDC150 μg 和 NHS100 μg。

1.2.2 偶聯(lián)方法 稱取4份100 μg OA分別放于4個(gè)燒杯中，每份中各加入上述交聯(lián)劑溶液10 μL，振蕩反應(yīng)15 min，然后各管中加1 mg/mL BSA－PBS液300 μL，靜止4℃中過夜，次日各裝透析袋對(duì)pH7.2 0.01 mol/L PBS透析，換液4次。然后取出偶聯(lián)物OA－BSA，按所加入抗體量及體積計(jì)算抗體濃度。

1.3OA-BSA在檢測(cè)線(T)工作濃度的確定

調(diào)整OA-BSA的包被濃度，按工藝組裝試劑條，以陽性標(biāo)本和PBS加樣比較不同包被濃度的靈敏度高低。

1.4 膠體金標(biāo)記單抗的制備

1.4.1 單抗純化 采用飽和硫酸銨法純化抗體［14］，再用親合層析柱進(jìn)一步純化。－20冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 鹽析抗體的定量 將鹽析單抗用PBS作1∶10稀釋，測(cè)定A260=0.337 4及A280=0.517 0，按公式A280×1.45－A260×0.74計(jì)算鹽析單抗的濃度。

1.5 膠體金的制備及對(duì)單抗的標(biāo)記

采用檸檬酸三納還原法制備不同直徑大小膠體金的制備［15］。標(biāo)記:分別取2 mL金溶膠與200單抗(質(zhì)量濃度50 ～400 μg/mL)，混勻，攪拌1 h;加入 BSA 20 mg，攪拌30 min，10 000 r/min 離心30 min，傾上清液，加入100 μL 20 mmol/L Tris－HCL(pH7.4)，攪拌，使沉淀溶解，再加入適量BSA使終濃度為10 mg/mL。放置于4℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.1 金標(biāo)時(shí)單抗?jié)舛鹊拇_定 用噴金機(jī)對(duì)各單抗質(zhì)量濃度(50，100，200，300，400μg/mL)標(biāo)記的金標(biāo)鼠抗OA進(jìn)行包被，均噴2.5 μL/cm，干燥后組裝試紙，以50 ng/mL OA陽性標(biāo)本和PBS加樣，比較不同單抗?jié)舛葘?duì)金標(biāo)單抗靈敏度的影響。

1.5.2 金標(biāo)鼠抗OA單克隆抗體包被量的確定 用噴金機(jī)對(duì)金標(biāo)抗OA單克隆抗體進(jìn)行包被，噴不同的噴量，干燥，按工藝組裝試紙條，以陽性標(biāo)本和PBS加樣比較不同包被量的檢測(cè)結(jié)果。

1.5.3 控制線(C)工作液濃度的確定 配制不同濃度的羊抗鼠IgG抗體，按工藝組裝試紙條，用PBS加樣，比較在不同包被濃度條件下對(duì)照線顯色的時(shí)間。

1.5.4 確定試紙條反應(yīng)時(shí)間 在各金標(biāo)反應(yīng)試紙板塊上，分別加50 ng/mL OA陽性標(biāo)本和PBS，設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)，A實(shí)驗(yàn)方案:反應(yīng)時(shí)間為2 min;B實(shí)驗(yàn)方案:反應(yīng)時(shí)間為3 min;C實(shí)驗(yàn)方案:反應(yīng)時(shí)間為5 min;D實(shí)驗(yàn)方案:反應(yīng)時(shí)間為10 min)，在2～10 min內(nèi)看T線顯色情況。

1.5.5 靈敏度的檢測(cè) 以各最佳實(shí)驗(yàn)條件制備金標(biāo)測(cè)試條，對(duì)各濃度單抗作靈敏度檢測(cè)。

1.6 加標(biāo)貝肉的膠體金測(cè)試

取新鮮貝類，洗凈，取貝肉，勻漿，取少量勻漿肉，加 OA 標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為3.08，6.25，12.5，25，50 ng/mL，每組設(shè)4個(gè)平行，提取物進(jìn)行膠體金試紙條檢測(cè)。

1.7 使用方法

若測(cè)試板條放在4℃中保持，由冰箱中取出后需在室溫中放置30 min后方能啟封。板條平放，在加樣區(qū)中滴加2滴樣品，3～5 min內(nèi)觀察記錄結(jié)果。同時(shí)做陽性樣品和PBS陰性樣品，以利對(duì)待檢樣本結(jié)果的判斷。T線不顯色及微顯色為陽性，接近或同PBS顯色為陰性。C線顯色為該板條有效，不顯色為板條已失效。置2～30℃中保存，遠(yuǎn)離潮濕和光照。有效期2 a。

2 結(jié)果與分析

2.1 交聯(lián)劑濃度的確定

以0.1 mg/mL OA-BSA包被反應(yīng)膜，以一定量的金標(biāo)單抗噴灑在膜上，以PBS作為陰性標(biāo)本比較T線的顯色強(qiáng)度，觀察不同濃度交聯(lián)劑的T線強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。顯示膠聯(lián)劑濃度高效果好，故在制備金標(biāo)條時(shí)采用EDC150 μg NHS100 μg/10μL作為交聯(lián)劑制備的OA-BSA。

表1 交聯(lián)劑及濃度對(duì)偶聯(lián)效果的影響Tab.1 Effect of crosslinking agents and concentration on crosslinking efficiency

2.2OA-BSA在檢測(cè)線(T)工作濃度的確定

調(diào)整OA-BSA的包被濃度，按工藝組裝試劑條，以陽性標(biāo)本和PBS加樣比較不同包被濃度的靈敏度高低，結(jié)果如表2所示。由表2可以得出:當(dāng)包被濃度為0.05 mg/mL時(shí)，既能滿足陽性標(biāo)本的檢出要求，又能達(dá)到PBS標(biāo)本的要求，而進(jìn)一步提高包被濃度則可能會(huì)降低OA的檢測(cè)靈敏度。降低包被濃度則不能滿足PBS標(biāo)本的檢出要求，T線會(huì)顯色更淺，綜合考慮最終確定OA-BSA檢測(cè)線包被濃度為0.05 mg/mL。

表2 OA－BSA不同包被濃度對(duì)OA檢測(cè)的影響Tab.2 Effect of different OA －BSA enveloping concentration on OA detection

2.3 膠體金顆粒大小確定

膠體金顆粒本身帶有紫色，其顆粒大小將直接影響試紙條上的檢測(cè)效果。只有同時(shí)滿足了陽性標(biāo)本檢測(cè)不出線和PBS標(biāo)本檢測(cè)顯色明顯這2個(gè)要求的顆粒大小才能用于試紙條檢測(cè)要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，顆粒大小為30 nm的膠體金能同時(shí)滿足陽性標(biāo)本檢出時(shí)間要求和PBS標(biāo)本檢測(cè)效果要求，因此選擇30 nm的膠體金顆粒用于標(biāo)記檢測(cè)和試紙條制備。

2.4 金標(biāo)單抗?jié)舛鹊拇_定

取膠體金2 mL，加入不同濃度的單抗進(jìn)行金標(biāo)記，制得的金標(biāo)抗體進(jìn)行試紙條檢測(cè)，檢測(cè)效果顯示，金標(biāo)記單抗?jié)舛葹?00 μg/mL時(shí)，陽性與陰性標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果最好。

2.5 金標(biāo)鼠抗OA單克隆抗體包被量的確定

用噴金機(jī)對(duì)金標(biāo)鼠抗OA單克隆抗體進(jìn)行包被，噴不同的噴量，以陽性標(biāo)本和PBS加樣比較不同包被濃度的靈敏度高低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:當(dāng)噴量達(dá)到2.5 μL/cm，陽性標(biāo)本和PBS標(biāo)本的檢出結(jié)果即已符合設(shè)計(jì)要求，綜合考慮最終確定金標(biāo)單抗的包被量，即噴金機(jī)噴量為2.5 μL/cm。

2.6 控制線(C)工作液濃度的確定

調(diào)整羊抗鼠IgG抗體濃度，按正常制備工藝組裝試紙條，用PBS加樣比較不同包被濃度對(duì)照線顯色時(shí)間。結(jié)果如表3。

表3 控制線(C)工作液濃度對(duì)金標(biāo)檢測(cè)效果的影響Tab.3 Effect of working liquid concentration for contorl line(C)on detecting efficiency for mcabs labeled with gold

包被濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)照線即在1 min清晰可辨，符合設(shè)計(jì)要求，最終確定對(duì)照線包被單抗鼠IgG濃度為1.0 mg/mL。

2.7 反應(yīng)時(shí)間的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:A方案。檢測(cè)區(qū)(T)無條帶，PBS顯色弱，測(cè)試不合格;B方案:檢測(cè)區(qū)(T)無條帶，PBS顯色強(qiáng)，測(cè)試合格;C方案:檢測(cè)區(qū)(T)無條帶，PBS顯色強(qiáng)，測(cè)試合格;D方案檢測(cè)區(qū)(T)有條帶，PBS顯色強(qiáng)，測(cè)試不合格。由此可知，選擇反應(yīng)時(shí)間為3～5 min觀察金標(biāo)測(cè)試結(jié)果效果最佳，10 min的測(cè)試結(jié)果為無效。

2.8 靈敏度測(cè)試結(jié)果

以各最佳實(shí)驗(yàn)條件制備的本批OA試紙條，對(duì)各濃度作靈敏度檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以肉眼不出線為標(biāo)準(zhǔn)，該批試紙條的靈敏度為12.5 ng/mL，參照酶標(biāo)50%抑制率為靈敏度判斷標(biāo)準(zhǔn)，則本金標(biāo)試劑條的靈敏度為6.25 ng/mL。圖1為試紙條測(cè)試結(jié)果，6.25 ng/mL微弱顯色，靈敏度即為6.25 ng/mL。

2.9 加標(biāo)貝肉樣品測(cè)試

用膠體金試紙條檢測(cè)貝肉模擬加標(biāo)的靈敏性。將OA標(biāo)準(zhǔn)品加入貝肉勻漿中，使終濃度分別為 3.08，6.25，12.5，25，50 ng/mL，每組設(shè) 4 個(gè)平行，提取物進(jìn)行膠體金試紙條檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)加標(biāo)濃度為12.5 ng/mL時(shí)，試紙條檢測(cè)線沒有顯色，完全是陽性結(jié)果;當(dāng)加標(biāo)濃度為6.25 ng/mL時(shí)，試紙條檢測(cè)線的顏色不夠穩(wěn)定，略微顯色，比控制線的顏色淺，檢測(cè)結(jié)果判斷為陰性;而當(dāng)加標(biāo)濃度為3.08 ng/mL時(shí)，試紙條檢測(cè)線的顏色和控制線的顏色完全一致，為陰性結(jié)果。由此檢測(cè)結(jié)果可知，研制的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條檢測(cè)加標(biāo)貝肉樣品時(shí)，其檢測(cè)靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)溶液一致，檢測(cè)線為6.25 ng/mL。

圖1 膠體金層析試紙條檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Immunochromatographic detection of OA using test strip

3 結(jié)論

本研究利用制備的軟海綿酸單克隆抗體研制了OA的膠體金層析檢測(cè)技術(shù)，確定了最佳的OA-BSA檢測(cè)線(T)工作濃度為0.05 μg/mL;確定了最佳大小的金顆粒為30 nm;確定了金標(biāo)時(shí)單抗?jié)舛葹?00 μg/mL;確定了金標(biāo)時(shí)單抗包被量為2.5 μL/cm;確定了最佳MC-LR-BSA和OA-BSA控制線(C)工作濃度為1.0 mg/mL;確定了反應(yīng)時(shí)間為3～5 min;制備了最低檢測(cè)線為6.25μg/mL的軟海綿酸膠體金檢測(cè)試紙條;用該試紙板條檢測(cè)實(shí)際樣品，檢測(cè)結(jié)果表明試紙板檢測(cè)效果較好，可以檢測(cè)較低濃度的毒素樣品，在一定程度上滿足了我國藻毒素的檢測(cè)要求。

建立的軟海綿酸藻毒素膠體金測(cè)試紙條的檢測(cè)限雖然與我國的毒素含量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)尚有一定差距，但經(jīng)過適當(dāng)前處理，同樣可以達(dá)到檢測(cè)水樣和食品是否符合國家標(biāo)準(zhǔn)效果，且整個(gè)檢測(cè)全過程時(shí)間僅為10～35 min，完全可以用于大量樣品初步篩查。由于膠體金試紙條檢測(cè)方法簡單、結(jié)果直觀、價(jià)格便宜、便于攜帶，因此，在水樣及水產(chǎn)品大量篩查中有更高的使用價(jià)值，與其他精細(xì)檢測(cè)方法結(jié)合使用，必能降少很大檢測(cè)工作量和節(jié)省大量檢測(cè)費(fèi)用。預(yù)計(jì)將在檢驗(yàn)檢疫、食品安全部門及衛(wèi)生監(jiān)控部門具有很好的應(yīng)用前景，有一定的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。同時(shí)，可為水產(chǎn)品食用安全檢測(cè)國際方法的修訂或增補(bǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

膠體金試紙板檢測(cè)快速、價(jià)廉，可用于大量樣品的初篩。且金標(biāo)檢測(cè)技術(shù)尚有優(yōu)化空間，可以進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)，尤其是優(yōu)化試紙條用材，可以提高試紙條檢測(cè)限度，并能直接達(dá)到世界衛(wèi)生組織的毒素最低含量標(biāo)準(zhǔn)。

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