姜黃素對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞遷移的抑制作用及對(duì)MMP2體內(nèi)外表達(dá)影響?

齊瑞芳，于小玲，趙 輝

(1.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060; 2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山東青島 266021)

姜黃素對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞遷移的抑制作用及對(duì)MMP2體內(nèi)外表達(dá)影響?

齊瑞芳1，2，于小玲2△，趙 輝2

(1.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060; 2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山東青島 266021)

目的:觀察不同濃度姜黃素對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞侵襲浸潤(rùn)的抑制作用以及對(duì)金屬基質(zhì)蛋白酶2(MMP2)表達(dá)的影響。方法:采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察姜黃素對(duì)PC3細(xì)胞遷移能力的影響;建立PC3裸鼠移植瘤，western blotting檢測(cè)PC3細(xì)胞和移植瘤組織中MMP2蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MMP2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果:姜黃素可減弱PC3細(xì)胞的遷移浸潤(rùn)能力，并下調(diào)MMP2的表達(dá)且呈劑量依賴性。結(jié)論:姜黃素可有效地抑制PC3細(xì)胞的遷移能力，下調(diào)MMP2的表達(dá)。

姜黃素;前列腺癌;侵襲;MMP2

中藥姜黃具有破血行氣、通經(jīng)止痛之功效，其主要有效成分為姜黃素(curcumin)［1］。姜黃素曾作為食物上色和佐餐劑廣泛用于食品工業(yè)［2］。近些年，姜黃素的藥理作用不斷被研究發(fā)現(xiàn)，如抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化等，尤其是抗癌抗腫瘤作用被人們逐步認(rèn)識(shí)并受到廣泛重視。本研究通過(guò)采用不同濃度的姜黃素作用于體外前列腺癌PC3細(xì)胞和體內(nèi)PC3細(xì)胞裸鼠移植瘤，觀察姜黃素對(duì)PC3細(xì)胞遷移浸潤(rùn)能力的影響，并檢測(cè)與PC3侵襲浸潤(rùn)能力有關(guān)系的金屬基質(zhì)蛋白酶2(matrix metalloproteinases MMP2)的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株—PC3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;胰蛋白酶、DMSO、BSA購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司;熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒; Trizol購(gòu)自大連Takara公司;PMSF、細(xì)胞蛋白裂解液購(gòu)自碧云天生物科技有限公司;MMP2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，姜黃素購(gòu)自Sigma公司(DMSO稀釋成50mmol/L母液保存于-20℃，用時(shí)室溫融化);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自基因公司; Olympus IX70-142倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 前列腺癌PC3細(xì)胞的培養(yǎng) 人前列腺癌細(xì)胞PC3培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 裸鼠移植瘤的建立 BALB雄性SPF級(jí)裸鼠24只，鼠齡4周，體質(zhì)量15～18 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。在恒溫(25～27℃)、恒濕(40% ～60%)、無(wú)特定病原體(Specific pathogen free，SPF)條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物飼養(yǎng)2周適應(yīng)環(huán)境。PC3細(xì)胞傳代培養(yǎng)3～4代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞胰酶消化，無(wú)血清的培養(yǎng)液或PBS洗滌。離心收集細(xì)胞，按照10×107/ml用PBS制成細(xì)胞懸液，每只抽取0.2 ml細(xì)胞懸液注射于右側(cè)腋窩處皮下，每天觀察記錄腫瘤形成情況。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)3 mm3時(shí)，將裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組各6只，腹腔注射藥物0.2 ml/次共30 d。①空白對(duì)照組生理鹽水隔日1次;②姜黃素組將姜黃素分為50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 3組，隔日1次。

1.2.3 細(xì)胞侵襲劃痕實(shí)驗(yàn) 在24孔板中加入5×105個(gè)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿融合，用細(xì)胞刮劃一約2 mm的線，PBS沖洗刮掉的細(xì)胞，然后加入不同濃度的姜黃素，無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞向無(wú)細(xì)胞劃痕區(qū)域遷移的情況。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3遍。每孔中隨機(jī)拍6個(gè)視野的劃痕照片，細(xì)胞遷移的平均距離用JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)來(lái)測(cè)量計(jì)算。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)MMP2蛋白表達(dá)

按說(shuō)明書加入PMSF和細(xì)胞裂解液常規(guī)提取PC3細(xì)胞及移植瘤組織中的蛋白，BCA法蛋白定量，每孔加入等量的蛋白進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，用5% BSA封閉1 h，加一抗稀釋液(1∶100稀釋)4℃過(guò)夜，TTBS洗膜，結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶200稀釋)，TTBS洗膜，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑在X光膠片上曝光、顯影、定影。以actin為內(nèi)參，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶掃描分析，結(jié)果以蛋白條帶的面積積分值與actin的面積積分值比值表示。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MMP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量 用Trizol提取細(xì)胞及移植瘤組織中的總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定其OD值，檢測(cè)其純度。如OD260/OD280在1.8～2.0之間，表明無(wú)蛋白質(zhì)污染。逆轉(zhuǎn)錄以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光PCR引物由大連寶生物公司設(shè)計(jì)合成，MMP2上游引物序列:5'-GATAACCTGGATGCCGT CGTG-3';下游引物序列:5'-CAGCCTAGCCAGTCGG ATTTG-3'。以GAPDH為內(nèi)參，上游引物序列:5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3';下游引物序列為: 5'-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3'。Real time PCR反應(yīng)條件:94℃ 3 min，90℃ 30 s，60℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)管均采用雙管取其平均值，所有PCR產(chǎn)物再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)為特異性條帶。用Real time PCR得到MMP2 mRNA的CT值分別與其相對(duì)應(yīng)GAPDH的CT值相減進(jìn)行校正得到校正CT值(即ΔCT)。以前列腺癌細(xì)胞空白對(duì)照檢測(cè)到的GAPDH mRNA熒光均值作為參數(shù)，目的基因相對(duì)表達(dá) 量 的 拷 貝 數(shù) 計(jì) 算 公 式［3］: 2-ΔΔCT= 2-(ΔCT目的基因-ΔCT對(duì)照基因)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)PC3細(xì)胞劃痕侵襲實(shí)驗(yàn)

表1圖1顯示，未加藥物對(duì)照組24 h后與加藥前比較，細(xì)胞呈梭型生長(zhǎng)并向劃痕區(qū)伸出偽足，細(xì)胞間距明顯縮小;姜黃素組在5～30 μmol/L范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞向劃痕區(qū)遷移生長(zhǎng)的能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 姜黃素對(duì)PC3細(xì)胞遷移距離的影響

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃素對(duì)PC3細(xì)胞遷移能力的影響

2.2 姜黃素對(duì)MMP2蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步研究姜黃素對(duì)PC3細(xì)胞侵襲浸潤(rùn)能力的影響，用 Western-Blot的方法檢測(cè)與PC3細(xì)胞侵襲浸潤(rùn)能力有關(guān)的MMP2蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5～30μmol/L的濃度范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，PC3細(xì)胞中MMP2蛋白表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)(見(jiàn)圖2);同樣裸鼠移植瘤中MMP2蛋白的表達(dá)隨姜黃素濃度增加而逐漸減弱(見(jiàn)圖3)，說(shuō)明姜黃素可下調(diào)MMP2蛋白表達(dá)。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MMP2 mRNA的表達(dá)

表2、3顯示，用Realtime PCR檢測(cè)PC3細(xì)胞和PC3細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中MMP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化，結(jié)果表明姜黃素可降低MMP2 mRNA的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 姜黃素對(duì)PC3細(xì)胞MMP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

表3 姜黃素對(duì)PC3細(xì)胞移植瘤組織MMP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

圖2 姜黃素對(duì)PC3細(xì)胞MMP2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

前列腺癌在美國(guó)位于男性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位、死亡率第二位［4］。在中國(guó)雖然發(fā)病率比較低，但死亡率較高，且隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的進(jìn)入，前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為影響老年男性健康的一大疾患。其發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已發(fā)生轉(zhuǎn)移，成為雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)，甚至是難治性的前列腺癌(HRPC)。目前臨床上雖有外科手術(shù)療法、激素療法、化學(xué)藥物療法等多種治療方法，但沒(méi)有一種方法能明顯提高前列腺癌患者的存活率，所以尋找有效的綜合治療方法顯得更加迫切。目前采用中醫(yī)藥治療晚期前列腺癌已得到許多中西醫(yī)同行的認(rèn)同，并成為新的研究熱點(diǎn)。

本研究通過(guò)體外培養(yǎng)前列腺癌PC3細(xì)胞并建立PC3細(xì)胞裸鼠移植瘤，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度姜黃素對(duì)PC3細(xì)胞遷移浸潤(rùn)能力的影響，然后通過(guò)western blotting方法檢測(cè)與侵襲浸潤(rùn)能力有關(guān)的MMP2蛋白的表達(dá)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MMP2 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制PC3細(xì)胞的侵襲浸潤(rùn)能力，下調(diào)MMP2蛋白及mRNA的表達(dá)，這將對(duì)臨床開(kāi)發(fā)綜合治療方法提供重要的理論依據(jù)。

近年來(lái)，姜黃素作為被研究的熱點(diǎn)抗腫瘤藥物，其抗腫瘤作用機(jī)制比較復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為可能主要與抑制腫瘤細(xì)胞增殖［5］、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［6］、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移［7］等有關(guān)。本課題組研究表明，姜黃素可抑制前列腺癌PC3細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡［8］。此外，姜黃素作為抗癌藥除具有常用抗腫瘤藥物的作用外，還有其自身的特點(diǎn)，如保護(hù)胃腸道、心血管系統(tǒng)、肝臟和腎臟功能等功能［9］，減輕化療藥物的毒副作用。如將其用于臨床，對(duì)于延長(zhǎng)患者生命、提高生活質(zhì)量會(huì)起到非常關(guān)鍵的作用。目前對(duì)姜黃素的藥效研究還處于實(shí)驗(yàn)階段，主要原因是姜黃素在腸道不易吸收，口服后的系統(tǒng)生物利用度相對(duì)較低。但是姜黃素具有抗癌譜廣、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，仍被腫瘤學(xué)家們認(rèn)為是一種潛在的第三代抗腫瘤藥。

［1］賈紹華，張舜堯.姜黃素藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3(22):188-189.

［2］Epstein J，Sanderson I R，Macdonald T T.Curcumin as a therapeutic agent:the evidence from in vitro，animal and human studies［J］.Br J Nutr，2010，9(1):8-14.

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［5］李彧，李亞?wèn)|，華穎，等.姜黃素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及Smads信號(hào)通路的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2013，19(8):902-906.

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Inhibition of Curcumin on Prostate Cancer PC3 Cell Invasion and Its Effect on the Expression of MMP2 in Vivo and in Vitro

QI Rui-fang1，2，YU Xiao-ling1△，ZHAO Hui2
(1．Preclinical and Forensic Medicine of Baotao Medical College，Inner Mongolia Baotao 014060，China; 2．Department of Pathophysiology，Medical College of Qingdao University，Shandong Qingdao 266021，China)

Objective:To observe the inhibitory effect of different concentrations of curcumin on prostate cancer PC3 cells and the effect on matrix metalloproteinase 2(MMP2)expression.Methods:Using Scratch test to observe the capacity of migration in PC3 cells;Prostate cancer cells PC3 xenografted tumors in nude mice were used.western blotting was applied to examine the protein of MMP2 in cell and xenografted tissues，real-time quantitative PCR was used to detect MMP2 mRNA.Results:Curcumin reduced the migratory ability of PC3 cells and downregulate the expression of MMP2，showing a dose-dependent manner.Conclusion:Curcumin can effectively inhibit the migratory ability of PC3 cell，reduced expression of MMP2.

Curcumin;Prostate cancer;Invasion;MMP2

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1398-03

2015-05-09

包頭醫(yī)學(xué)院秦文斌基金(201107)

齊瑞芳(1982-)，女，內(nèi)蒙古包頭人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事腫瘤的基因診斷及防治研究。

△通訊作者:于小玲(1964-)，女，山東人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事腫瘤的基因診斷、防治及藥理藥代研究。