應(yīng)用代謝組學(xué)探討脾氣虛大鼠血清小分子代謝譜群特征變化?

徐 熒，賈連群，杜 瑩，甄畢賢，楊關(guān)林

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)省部共建中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實驗室，沈陽 110847)

應(yīng)用代謝組學(xué)探討脾氣虛大鼠血清小分子代謝譜群特征變化?

徐 熒，賈連群，杜 瑩，甄畢賢，楊關(guān)林△

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)省部共建中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實驗室，沈陽 110847)

目的:運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)探究脾氣虛模型大鼠血清小分子代謝譜群特征變化，從而探索脾氣虛證的生物學(xué)本質(zhì)。方法:14只SPF級雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組和脾氣虛證模型組各7只，模擬中醫(yī)病因建立脾氣虛大鼠模型。運(yùn)用LC-Q/TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)對2組大鼠血清樣本進(jìn)行檢測，通過主成分分析(PCA)、最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)比較2組大鼠血清代謝圖譜，尋找差異性表達(dá)代謝物。結(jié)果:脾氣虛大鼠與正常大鼠的血清代謝圖譜間存在顯著差異。與正常大鼠比較，脾氣虛大鼠血清中葡萄糖、琥珀酸等小分子代謝物含量顯著上升，雄酮、亞油酸等含量顯著下降，通過OPLS-DA分析得到一些脾氣虛證的潛在生物標(biāo)志物。結(jié)論:脾氣虛大鼠呈現(xiàn)出不同于健康大鼠的血清代謝譜群特征，該證型存在多種代謝通路異常，可能伴隨機(jī)體能量供應(yīng)障礙，也可能誘發(fā)糖尿病及心血管疾病。

脾氣虛證;代謝組學(xué);大鼠;血清

脾氣虛是中醫(yī)臨床的一種常見證型，與消化系統(tǒng)、能量代謝、心血管功能等多種系統(tǒng)功能的紊亂失常有關(guān)［1］。目前已確認(rèn)的脾氣虛特異性指標(biāo)中較為公認(rèn)的只有唾液淀粉酶和D-木糖排泄率，且這2項指標(biāo)只能反映脾氣虛證的局部［1］，因此對于脾氣虛證實質(zhì)的研究仍有待深入。代謝組學(xué)是通過定量檢測生物體受到外界刺激和遺傳修飾后生物基質(zhì)中各種代謝產(chǎn)物的變化來研究生物體系代謝網(wǎng)絡(luò)的一種技術(shù)方法［2］，其研究對象是生物體整體代謝物，與中醫(yī)理論的“整體觀念”相一致，因此適用于中醫(yī)證候的研究。本實驗通過建立脾氣虛證動物模型，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)，分析脾氣虛大鼠與健康大鼠的血清差異性小分子代謝物及其相關(guān)代謝通路，從而探索脾氣虛證的生物學(xué)本質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與建模

14只健康雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(200± 10)g，購于本溪實驗動物中心(許可證號 SCXK (遼)-2010-0001)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組(正常組)和脾氣虛證模型組(脾氣虛組)每組7只。于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心(許可證號SYXK(遼)-2013-000-9)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫18～23℃，相對濕度45% ～55%，自由飲水進(jìn)食。1周后，正常組維持適應(yīng)性飼養(yǎng)條件繼續(xù)飼養(yǎng)15 d。脾氣虛組使用飲食不節(jié)加力竭游泳方法建立脾氣虛證模型，3 d為1個循環(huán)，先飽食1 d再禁食2 d，自由飲水，每日35～37℃水溫游泳至力竭，連續(xù)15 d共5個循環(huán)。脾氣虛證評定標(biāo)準(zhǔn)為食少、神疲乏力、消瘦、毛色枯槁無光澤，造模成功率約為80%。

1.2 血清采集與樣品制備

腹腔注射10%水合氯醛麻醉，采用大鼠腹主動脈取血，靜置2 h后4℃離心(2500 rpm)20 min并收集血清分裝，-80℃保存。取冷凍儲存的樣本，室溫下解凍15 min，渦漩震蕩5 s。取100 μL樣本加入300 μL HPLC級甲醇，渦漩震蕩30 s，4℃靜置20 min。4℃冷凍離心(12000 rpm)15 min，取200 μL上清液轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶，進(jìn)行LC/MS檢測分析。實驗試劑為甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(美國默克公司色譜級試劑)，實驗用水為蒸餾水。

1.3 LC/MS質(zhì)譜檢測

實驗儀器分析平臺為LC-Q/TOF-MS(Agilent，1290 Infinity LC，6530 UHD and Accurate-Mass QTOF/MS)，分離色譜柱為C18色譜柱(Agilent，100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。色譜分離條件:柱溫40℃，流速0.4 ml/min，流動相組成A:水+0.1%甲酸，B:乙腈+0.1%甲酸。自動進(jìn)樣器溫度4℃，進(jìn)樣量5 μL。

表1 質(zhì)譜梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件:以氮?dú)庾鳛殪F化、錐孔氣;飛行管檢測模式V型。毛細(xì)管電壓(capillary voltage)4 kV，錐孔電壓(Sampling cone)35 kV，離子源溫度(Sourcetemperature)100 ℃;脫溶劑氣 溫 度 (Desolvation temperature)350℃，反向錐孔氣流(Cone gas flow)50 L/h，脫溶劑氣(Desolvation gas flow)600 L/h，萃取錐孔(Extraction cone)4 V。離子掃描時間(Scan time)0.03 s，掃描時間間隔(Inter scan time)0.02 s，數(shù)據(jù)采集范圍100～1000 m/z。為確保質(zhì)量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，應(yīng)用亮氨酸-腦啡肽作為鎖定質(zhì)量(Lock mass)，正離子模式下產(chǎn)生［M +H］+離子556.2771 Da，負(fù)離子模式下產(chǎn)生［MH］-離子554.2615 Da。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用的載玻片和蓋玻片必須無劃痕且無灰塵，物鏡前透鏡也須清潔無塵。載玻片與蓋玻片的厚度應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)。載玻片太厚，聚光器的焦點(diǎn)將落在載玻片內(nèi)，達(dá)不到被檢物體的平面上；使用油鏡頭時，由于物鏡的工作距離很短，甚至無法調(diào)焦，從而看不到或看不清被檢物體。

通過安捷倫工作站MassHunter對所有原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理并導(dǎo)出mz格式數(shù)據(jù)。在R軟件平臺下采用xcms程序代碼進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括基線過濾、峰識別，進(jìn)行保留時間校正、峰對齊和質(zhì)譜碎片歸屬等分析。最后在EXCEL2007軟件中進(jìn)行后期編輯，包括來自于柱流失和樣本制備造成的雜質(zhì)峰剔除和定量離子選擇等。將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量(rt_mz，即保留時間-質(zhì)荷比)、觀察量(樣本)和峰強(qiáng)度。將所有數(shù)據(jù)歸一化到總信號積分，將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P軟件(版本11.0)，進(jìn)行主成分分析(PCA)、最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)。采用 OPLS-DA模型第一主成分的VIP值(Variable Importance in the Projection)(閾值＞1)，并結(jié)合學(xué)生氏 t檢驗(t-test)的 P值(閾值0.05)來尋找差異性表達(dá)代謝物。定性方法為搜索公共網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(Metlin以及HMDB)。

圖1 正常組與脾氣虛組TIC色譜圖

2 結(jié)果

2.1 血清代謝TIC色譜圖分析

圖1顯示，采用LC/MS質(zhì)譜ESI正離子和負(fù)離子模式，對正常對照組(正常組)和脾氣虛證模型組(脾氣虛組)的動物血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析。2組動物血清的總離子流(TIC)色譜圖顯示，各組分的分離效果較好，且在正離子和負(fù)離子模式下2組的TIC圖譜均存在明顯差異。

2.2 血清代謝多元統(tǒng)計分析

圖2顯示，ESI正離子模式和負(fù)離子模式下樣本均處于橢圓形區(qū)域內(nèi)(95%置信區(qū)間)，且分析參數(shù)R2X［R2X(+)=0.576;R2X(-)=0.507］均大于0.4，因此該組PCA模型能可靠解釋樣本間的代謝差異。PCA得分圖(見圖2)顯示，脾氣虛組與正常組在正離子和負(fù)離子模式下均沿t［1］軸方向基本分開，2組間無明顯交叉重疊，說明2組樣本間血清代謝圖譜存在顯著差異。

圖2 正常組與脾氣虛組PCA得分散點(diǎn)分布圖

通過主成分分析未發(fā)現(xiàn)異常需要剔除的樣本，所以進(jìn)一步采用最小二乘判別分析(PLS-DA)進(jìn)行建模分析。圖3顯示，ESI正離子和負(fù)離子模式下樣本均處于橢圓形區(qū)域內(nèi)(95%置信區(qū)間)，且模型的解釋率 R2Y［R2Y(+)=0.997;R2Y(-)= 0.989］與預(yù)測率Q2［Q2(+)=0.897;Q2(-)= 0.857］均大于0.4，因此該組PLS-DA模型也能可靠地解釋樣本間的代謝差異。PLS-DA得分圖(圖3)顯示，脾氣虛組與正常組在正離子模式下被圖中所示虛線基本分開，在負(fù)離子模式下沿t［1］軸方向基本分開，2組間無明顯交叉重疊，進(jìn)一步說明2組樣本間血清代謝圖譜存在顯著差異。

圖3 正常組與脾氣虛組PLS-DA得分散點(diǎn)分布圖

2.3 血清差異性代謝物分析

表2、3顯示，通過正交偏最小二乘(OPLS-DA)分析，ESI正離子模式下正常組與脾氣虛組間確認(rèn)了49個差異性代謝物，負(fù)離子模式下2組間確認(rèn)了28個(4個與正模式下重復(fù))差異性代謝物。與正常組比較，脾氣虛組中葡萄糖、琥珀酸、胸苷等44個小分子代謝物在血清中濃度顯著上升(P＜0.05)，雄酮、亞油酸、苯丙氨酸等29個小分子代謝物濃度顯著下降(P＜0.05)。

3 討論

代謝組學(xué)是一門新興的現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)比較具有顯著優(yōu)勢［2］。其研究對象是生物體整體代謝物，與中醫(yī)整體觀相吻合，近年來開始應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究中。本實驗運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)，清晰直觀地反映正常對照組(正常組)和脾氣虛證模型組(脾氣虛組)間存在代謝圖譜的顯著差異，并確認(rèn)了2組間的差異性代謝物，說明血清代謝組學(xué)分析能夠較好地反映中醫(yī)模型的組間差異，是展開中醫(yī)證候研究的有效方法。

3.2 脾氣虛證的潛在生物標(biāo)志物

差異性代謝物分析結(jié)果顯示，與健康大鼠比較，脾氣虛大鼠血清中磷脂酸(18∶3)、馬尿酸、吲哚乙酸、胸苷、三烯生育酚、3-Oxocholic acid、膽酸、L-(-)-3-苯基乳酸、D(-)-β-羥基丁酸、2-oxo羊蠟酸等小分子代謝物濃度改變較為明顯，這些小分子代謝物可作為脾氣虛證潛在生物標(biāo)志物做進(jìn)一步研究。

表2 ESI正離子模式下正常組與脾氣虛組血清差異性代謝物

3.3 脾氣虛證是機(jī)體多種代謝通路異常的共同結(jié)果

中醫(yī)認(rèn)為，脾為“后天之本，氣血生化之源”。脾氣虛是中醫(yī)臨床常見的一種證型，涉及消化、免疫、內(nèi)分泌等系統(tǒng)功能紊亂。本實驗運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)分析比較了脾氣虛大鼠與健康大鼠的血清代謝圖譜。LC/MS質(zhì)譜分析和多元統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，脾氣虛大鼠與健康大鼠的血清代謝圖譜間存在顯著差異。差異性代謝物分析結(jié)果進(jìn)一步顯示，2組動物血清中許多小分子代謝物含量存在顯著差異，說明比較健康大鼠脾氣虛大鼠的相關(guān)代謝通路發(fā)生了改變。

表3 ESI負(fù)離子模式下正常組與脾氣虛組血清差異性代謝物

3.3.1 能量代謝方面 與健康大鼠比較，脾氣虛大鼠血清中琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸的含量水平顯著升高。琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，其水平升高提示三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物堆積，說明脾氣虛大鼠存在三羧酸循環(huán)障礙。這可能是由于一些參與三羧酸循環(huán)的酶活性降低或線粒體功能異常。有研究顯示，脾虛大鼠琥珀酸脫氫酶的活性較健康大鼠顯著降低［3-4］。臨床試驗發(fā)現(xiàn)，脾氣虛患者十二指腸細(xì)胞線粒體有明顯腫脹、變形等形態(tài)改變，線粒體DNA序列存在多態(tài)性改變［5-6］。脾氣虛大鼠的三羧酸循環(huán)障礙說明，脾氣虛證可能伴隨嚴(yán)重的能量代謝異常，從而導(dǎo)致機(jī)體能量供應(yīng)不足和氣血運(yùn)行不暢，進(jìn)而表現(xiàn)出神疲乏力、肢體倦怠等癥狀。

3.3.2 糖代謝方面 近代許多醫(yī)家認(rèn)為，脾氣虛能導(dǎo)致脾失健運(yùn)引起“脾不散精”，血糖無以調(diào)節(jié)利用而積蓄，因此糖尿病的發(fā)病與脾氣虛密切相關(guān)［7-8］。本實驗結(jié)果顯示，脾氣虛大鼠血清中葡萄糖濃度與健康大鼠比較顯著升高，進(jìn)一步證實脾氣虛證可能伴隨糖代謝異常從而導(dǎo)致血糖升高。

3.3.3 脂類代謝與健康大鼠比較 脾氣虛大鼠亞油酸、亞麻酸、十二碳二烯酸、二十碳二烯酸等不飽和脂肪酸含量顯著降低。不飽和脂肪酸能夠酯化膽固醇，降低血液中膽固醇和甘油三酯含量，從而降低血液黏稠度，改善血液微循環(huán)，調(diào)節(jié)心臟功能［9-10］。脾氣虛大鼠不飽和脂肪酸不足，可能導(dǎo)致血液中低密度脂蛋白和膽固醇含量增加，從而引發(fā)動脈粥樣硬化或其他心血管疾病。其次，脾氣虛大鼠血清中肉毒堿與棕櫚酰肉堿含量較健康大鼠顯著降低。肉毒堿與棕櫚酰肉堿可以轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體內(nèi)進(jìn)行β氧化和三羧酸循環(huán)，是脂類代謝中重要的輔助因子［11］。脾氣虛大鼠肉毒堿與棕櫚酰肉堿缺乏，可能阻礙脂肪酸的氧化代謝，使血脂升高，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化或其他心血管疾病。D (-)-β-羥基丁酸是脂肪酸β氧化代謝的一種產(chǎn)物，與健康大鼠比較，脾氣虛大鼠血清中D(-)-β-羥基丁酸含量顯著降低，進(jìn)一步證實脾氣虛大鼠脂肪酸氧化代謝受阻的結(jié)論。以上結(jié)果說明，脾氣虛證存在脂類代謝紊亂，可能誘發(fā)動脈粥樣硬化等心血管疾病。

其他代謝方面，與健康大鼠比較脾氣虛大鼠瓜氨酸、胸苷、磷酸吡哆醇(參與維生素B6代謝)等小分子代謝物的含量水平顯著升高，苯丙氨酸、尿苷、胞嘧啶、維生素A等小分子代謝物的含量水平顯著降低，說明脾氣虛大鼠還可能存在氨基酸代謝、核苷酸代謝、維生素代謝等其他代謝通路異常。

綜上所述，中醫(yī)脾氣虛證與糖代謝、脂類代謝、氨基酸代謝等多種代謝通路異常有關(guān)，是機(jī)體多個系統(tǒng)功能改變的共同結(jié)果。脾氣虛證可能伴隨機(jī)體能量供應(yīng)障礙，并可能誘發(fā)糖尿病及心血管疾病。

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Metabolic spectrum group changes of the serum small molecule on spleen deficiency rat by the application of metabonomics

XU Ying，JIA Lian-qun，DU Ying，ZHEN Bi-xian，YANG Guan-lin△
(Key Laboratory of Ministry of Education for TCM Viscera-State Theory and Applications，Ministry of Education of China (Province-Ministry Co-construct)，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang Liaoning 110847，China)

Objective:To study the changes in the characteristics of serum metabolism in rats with spleen-qi deficiency，in order to investigate the essence of spleen-qi deficiency.Methods:14 male SD SPF rats were randomly assigned into two groups which were the spleen-qi deficiency model group and the normal control group.Each group had 7 rats.Spleen-qi deficiency rat model was established simulating traditional Chinese medicine cause of disease.LC-Q/TOFMS was used to exam the serum samples of the rats.The serum metabolism was compared between the spleen-qi deficiency model group and the normal control group via PCA，PLS-DA and OPLS-DA analysis.Metabolites with levels significantly different between these two groups were identified.Results:There were significant differences in serum metabolism between rats in the spleen-qi deficiency group and those in the normal control group.Levels of some metabolites such as glucose，succinic acid.were significantly increased and those of androsterone，linoleic acid.were significantly decreased in rats with spleen-qi deficiency compared to healthy rats.Conclusion:Rats with spleen-qi deficiency showed different characteristics of serum metabolism compared to healthy rats.Spleen-qi deficiency was accompanied with abnormality in many metabolism systems.It was also associated to insufficient energy supply and may lead to diabetes and some cardiovascular diseases.

Spleen-qi deficiency;Metabonomics;Rats;Serum

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1382-05

2015-03-18

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(201133CB531700)

△通訊作者:楊關(guān)林，Tel:024-31207046，E-mail:yang_ guanlin@163.com。