腎絡(luò)通對糖尿病腎病大鼠podocin、CD2AP的影響?

潘利敏，方 超，婁菲菲，張江華，郭立芳，王月華，李 英

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊 050081;2.河北省中醫(yī)院，石家莊 050011; 3.河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊 050017)

腎絡(luò)通對糖尿病腎病大鼠podocin、CD2AP的影響?

潘利敏2，方 超3，婁菲菲3，張江華3，郭立芳2，王月華1△，李 英1

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊 050081;2.河北省中醫(yī)院，石家莊 050011; 3.河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊 050017)

目的:探討腎絡(luò)通(益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)為法)對糖尿病腎病大鼠24 h尿白蛋白定量(UAlb)及腎組織podocin、CD2AP的影響。方法:70只大鼠隨機選取10只作為正常對照組，其余60只大鼠均行腹腔注射STZ(55 mg·kg－1·d－1)1次，3 d后測空腹血糖≥16.7 mmol/L者按隨機數(shù)字表法分為模型組、中藥組及厄貝沙坦組，按各組相應(yīng)藥物劑量灌胃。于第24周末檢測各組大鼠24 h UAlb定量，免疫組化法測腎組織podocin、CD2AP蛋白表達。結(jié)果:各治療組與模型組比較24 h UAlb明顯減少，podocin、CD2AP蛋白表達顯著增加。結(jié)論:益氣養(yǎng)陰、消癥通絡(luò)中藥腎絡(luò)通可能通過減少podocin、CD2AP蛋白的丟失，使腎小球濾過膜的完整性得到一定程度的恢復(fù)，而減輕糖尿病腎病大鼠蛋白尿。

腎絡(luò)通;糖尿病大鼠;24 h尿白蛋白定量;podocin;CD2AP

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)作為糖尿病的主要微血管病變，是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一。隨著我國糖尿病發(fā)病率逐年升高，DN的發(fā)病率也隨之上升，因此有效防治DN是糖尿病和腎病學(xué)者共同面臨的一項重要工作。有研究表明，腎組織podocin、CD2AP等表達異常，與蛋白尿發(fā)生密切相關(guān)［1－2］。而前期研究已證實，益氣養(yǎng)陰、消癥通絡(luò)中藥腎絡(luò)通能夠通過對DN大鼠nephrin的影響發(fā)揮對DN的治療作用［3］。因此本研究繼以DN動物模型為研究對象，觀察腎絡(luò)通(益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)為法)對 DN大鼠 24 h尿白蛋白及腎組織podocin、CD2AP蛋白的影響，為中藥復(fù)方制劑延緩DN提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

本實驗研究選用雄性清潔級SD大鼠70只，體質(zhì)量(200±10)g，由河北醫(yī)科大學(xué)動物中心提供(合格證號1312053)。

1.2 主要藥物與試劑

腎絡(luò)通由黃芪、玄參、地龍、僵蠶、烏梢蛇等組成，經(jīng)粉碎、水煎濃縮至含生藥3 g/ml(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院制劑室提供)，厄貝沙坦(由杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產(chǎn))，兔抗大鼠podocin、CD2AP蛋白抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG及鏈酶親和素－生物素復(fù)合素(北京中杉公司)。

1.3 主要儀器

電子微量秤(奧豪斯公司)，ONETOUCH Ultra穩(wěn)豪型血糖儀(美國強生公司)，全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)，光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器六廠)，超低溫冰箱(illus公司)，數(shù)碼像機(model Penguin 600CL，Pixera Inc，美國)，搖床(LSR－2AD，美萊博)。

1.4 方法

1.4.1 分組、造模及給藥方法 70只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后分別置代謝籠里取尿，測定尿蛋白及尿紅細(xì)胞全部陰性，隨機選取10只作為正常對照組，其余60只大鼠均行腹腔注射STZ(55 mg·kg－1·d－1)1次，3 d后尾尖采血。血糖儀測空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L者按隨機數(shù)字表法分為模型組、中藥組及厄貝沙坦組開始灌胃給藥，中藥組給予11.2 g·kg－1·d－1，厄貝沙坦組給予15 mg·kg－1· d－1(給藥劑量參照文獻［4］計算)，共給藥24周。分別在實驗第24周末于代謝籠里留取24 h尿后，采用全自動生化儀測定24 h尿白蛋白量，股動脈取血并取右側(cè)腎組織待測。

1.4.2 免疫組化方法檢測podocin、CD2AP蛋白表達 常規(guī)蠟塊包埋腎組織，切片(厚度為4 um)抗原修復(fù)后，過氧化氫10 min，正常羊血清封閉30 min，再依次用一抗(4℃過夜)及二抗孵育(室溫30 min)。以磷酸鹽緩沖液及非免疫的兔血清代替一抗作為空白對照。DAB試劑盒顯色后，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，普通光鏡下觀察腎組織podocin、CD2AP蛋白的分布情況，應(yīng)用ImagePro Plus圖像分析軟件測定各組OD值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差異(LSD)法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況

實驗過程中，模型組、中藥組及厄貝沙坦組各有1只大鼠血糖恢復(fù)正常并剔除。正常對照組大鼠飲食正常，眼睛有神，被毛光澤，反應(yīng)敏捷，糞便呈麥粒狀，尿量正常。造模各組注射STZ后均出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀，并逐漸出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、身體消瘦。治療期間造模各組均有大鼠死亡情況，其中模型組和中藥組死亡3只，厄貝沙坦組死亡2只，死亡原因可能為高血糖引起的代謝紊亂。

2.2 各組大鼠24 h尿白蛋白定量比較

表1顯示，與正常對照組比較，模型組、厄貝沙坦組、中藥組24 h尿白蛋白顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，厄貝沙坦組、中藥組24 h尿白蛋白均有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，厄貝沙坦組與中藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察

圖1顯示，正常對照組腎組織未見明顯病理改變，模型組、中藥組及厄貝沙坦組大鼠可見腎小球肥大，系膜區(qū)增寬，基質(zhì)增加，腎小球基膜增厚，腎小囊腔變窄，各治療組病理改變較模型組輕。

圖1 各組大鼠光鏡下病理形態(tài)學(xué)結(jié)果(PAS染色 ×400)

2.4 各組大鼠腎組織podocin、CD2AP免疫組化結(jié)果

圖2、3表1顯示，正常對照組腎組織可見podocin、CD2AP大量表達，模型組較正常組podocin、CD2AP表達明顯減少，中藥組及厄貝沙坦組較模型組podocin、CD2AP表達明顯增加，各治療組病理改變較模型組輕。

圖2 各組大鼠光鏡podocin免疫組化結(jié)果(×400)

圖3 各組大鼠光鏡CD2AP免疫組化結(jié)果(×400)

表1 各組大鼠U Alb和podocin、CD2AP比較(±s)

表1 各組大鼠U Alb和podocin、CD2AP比較(±s)

注:與正常對照組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:▲▲P＜0.01

組 別 鼠數(shù) U Alb(ug/24 h)podocin CD2AP正常對照組0.00 0.00 0.00 10 3.4±0.99 1.130±0.019 1.230±0.034模 型 組 16 94.8±2.43＊＊ 0.288±0.010＊＊ 0.340±0.026＊＊厄貝沙坦組 17 54.5±2.38＊＊▲▲0.428±0.014＊＊▲▲ 0.539±0.033＊＊▲▲中 藥 組 16 55.3±1.92＊＊▲▲0.748±0.016＊＊▲▲ 0.638±0.020＊＊▲▲F3989.5 6162.95 1699.07 P

3 討論

糖尿病腎病是常見的糖尿病微血管嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因。因DN病程遷延，且臨床上一旦出現(xiàn)大量蛋白尿則腎臟損害往往難以逆轉(zhuǎn)，患者將逐漸進入終末期腎病并需要長期腎臟替代治療，因此深入開展DN發(fā)病機制及防治措施的研究具有重要意義。

DN的主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿。腎小球濾過屏障由腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、臟層上皮細(xì)胞(足細(xì)胞)足突構(gòu)成，當(dāng)腎小球濾過膜的完整性及其功能發(fā)生改變時則產(chǎn)生蛋白尿，即蛋白尿是反映腎小球濾過屏障對血漿蛋白通透性增高的特征性臨床表現(xiàn)。足細(xì)胞足突通過 α3β1整合素與 α－βdystroglycans鉚釘于腎小球基底膜(GBM)上;相鄰足突之間的裂孔膜是腎小球濾過屏障的重要結(jié)構(gòu)和功能單位，由nephrin、podocin、CD2AP等多種蛋白質(zhì)分子組成［5］。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者腎小球Nephrin表達減少，引起足細(xì)胞損傷脫落，濾過屏障功能破壞，通透性增加，尿蛋白排出增加［6］。podocin的羧基端結(jié)構(gòu)域與CD2AP及nephrin相結(jié)合成蛋白復(fù)合體，介導(dǎo)裂孔隔膜與足突的細(xì)胞骨架相連。有研究表明，在腎小球提取物中這些蛋白可發(fā)生免疫共沉淀，提示在體內(nèi)podoein與CD2AP和nephrin之間存在著相互作用［7］。由于CD2AP無論在體外還是體內(nèi)均與nephrin有著直接的相互作用，因此CD2AP很可能在介導(dǎo)podocin與nephrin的相互作用中起銜接蛋白的作用。如果裂孔隔膜中任何一種關(guān)鍵成分nephrin、CD2AP或podocin出現(xiàn)表達改變時，均可能導(dǎo)致大量蛋白尿發(fā)生。除對維持裂孔隔膜的正常結(jié)構(gòu)與功能具有重要作用外，CD2AP可與 nephrin及 podocin結(jié)合參與足細(xì)胞信號傳導(dǎo)［8］。而前期研究已證實，益氣養(yǎng)陰、消癥通絡(luò)中藥，即腎絡(luò)通能夠通過對DN大鼠nephrin的影響發(fā)揮對DN的治療作用，因此本研究繼以DN動物模型為研究對象，觀察腎絡(luò)通對 DN大鼠腎組織podocin、CD2AP蛋白的影響。

課題組認(rèn)為，DN的基本病機是氣虛無力運血而致血瘀，陰虛火旺、煎熬津液、津虧液少則血液黏稠不暢而致“陰虛血瘀”，病久不愈深伏于腎絡(luò)漸成微小癥積，致使腎體受損、腎用失司導(dǎo)致DN的發(fā)生。結(jié)合“病久必瘀、病久入絡(luò)”的中醫(yī)學(xué)理論，提出該病證病位在絡(luò)，“瘀血癥積阻于腎絡(luò)”可能是病機之關(guān)鍵，同時結(jié)合DN氣陰兩虛的基本病機，經(jīng)過臨證的反復(fù)篩選，確定了一個相對固定治療DN的基本方腎絡(luò)通，以消癥通絡(luò)為主兼以益氣養(yǎng)陰。其中黃芪、玄參益氣養(yǎng)陰，地龍、僵蠶、烏梢蛇、鱉甲等消癥通絡(luò)，取得了較好的臨床療效。綜合以上研究，足細(xì)胞及其裂孔隔膜中任何一種關(guān)鍵成分nephrin、CD2AP或podocin損傷在DN發(fā)病中的作用已經(jīng)確定，探索以足細(xì)胞為靶點的治療機制對探討新的DN治療和預(yù)防手段具有極其重要的意義。本實驗結(jié)果顯示，實驗第24周造模各組podocin、CD2AP蛋白顯著下降，與上述報道一致。而進一步觀察模型組podocin、CD2AP蛋白表達低于其他各組，中藥組及厄貝沙坦組均能使腎組織中podocin、CD2AP蛋白表達上調(diào)，提示益氣養(yǎng)陰、消癥通絡(luò)中藥及厄貝沙坦可能通過減少podocin、CD2AP蛋白的丟失，使腎小球濾過膜的完整性得到一定程度的恢復(fù)而減輕蛋白尿。中藥組與厄貝沙坦組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但中藥長期療效發(fā)揮有待進一步的研究。

［1］Yasuno K，Araki S，Sakashita H，et al.Development of podocyte injuries in osborne－mendel rats is accompanied by reduced expression of podocyte proteins［J］.J Comp Pathol，2013，pii:s0021－9975(13):00029－7.

［2］Nakatsue T，Koike H，Han GD，et al.Nephrin and podocin dissociate at the onset of proteinuria in experimental membranous nephropathy［J］.Kidncv Int，2005，67(6):2239－2253.

［3］王月華，潘利敏，方超，等.腎絡(luò)通對糖尿病腎病大鼠裂孔膜蛋白的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2014，20(11): 1496－1498.

［4］黃繼漢，黃曉輝，陳志楊，等.藥理實驗中動物間和動與人體間的等效劑量換算［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9 (9):1069－1072.

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Effects of Shen Luo Tong on CD2AP and Podocin in Rats with Diabetic Nephropathy

PAN Li－min2，F(xiàn)ANG Chao3，LOU Fei－fei3，ZHANG Jiang－h(huán)ua3，GUO Li－fang2，WANG Yue－h(huán)ua1△，LI Ying1
(1．No 3 Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050081，China; 2．TCM Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China;3．Hebei Midical University，Shijiazhuang 050017，China)

Object:To investigate the effects of Shen Luotong(Supplementing Qi－Nourishing Yin－Dispersing Blood Stasis－Dredging Collateral Recipe)on 24 hour UAlb，podocin and CD2AP in earlier diabetic nephropathy(DN)rats. Methods:Select 10 rats randomly from 70 rats as control group and inject the rest 60 rats in their enterocoelia with STZ(55 mg·kg－1·d－1)once.Rats with FBG over 16.7mol/L after 3d were randomly divided into three groups:model group、Chinese medicine group and irbesartan group.The 24 hour UAlb，podocin and CD2AP protein expression were tested by the end of the 24th week.Result:Compared with model group，24 hour UAlb in treated groups decreased significantly.But the protein expression of podocin and CD2AP in treated groups increased significantly in contrast with model group. Conclusion:Supplementing Qi－Nourishing Yin－Dispersing Blood Stasis－Dredging Collateral Recipe—Shen Luotong has a preventing function on kidney in the loss of podocin and CD2AP protein，thus recovering the integrity of glomerular filtration membrane to a certain extant which can lessen the albuminuria of diabetic nephropathy(DN)rats.

Shen Luotong;Diabetic rats;24 hour UALB;Podocin;CD2AP

R285.5

:B

:1006－3250(2015)12－1511－03

2015－04－11

國家自然科學(xué)基金資助項目(81202829)－益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)法對糖尿病腎病大鼠及高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞的影響

潘利敏(1970－)，女，河南通許人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事內(nèi)科疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:王月華(1973－)，女，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事慢性腎臟病的臨床與基礎(chǔ)研究，Tel: 18533112216，E－mail:wangyuehua@medmail.com.cn。