乳酸片球菌素Ped-A基因表達載體的構建

穆熙軍，劉秀俠，許燕俠，孫學森，谷　?。ㄉ綎|寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安　271000）

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乳酸片球菌素Ped-A基因表達載體的構建

穆熙軍，劉秀俠，許燕俠，孫學森，谷巍
（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

摘要：乳酸片球菌素可以作為防腐劑延長食品的保鮮期，為研究和開發(fā)可食用級別的防腐劑，將乳酸片球菌素結構基因Ped-A全長和不含信號肽的序列克隆至乳酸菌表達載體pMG36e和pNZ8048，經酶切鑒定及序列分析，所轉化的大腸桿菌DH5α和DHB4中含有插入Ped-A基因全長和不含信號肽的序列的重組質粒。結果表明，成功構建了乳酸片球菌素Ped-A基因的乳酸菌表達載體pMG36e/Ped-A（全長/片段）、pNZ8048/Ped-A（全長/片段）。

關鍵詞：乳酸片球菌素Ped-A；乳酸菌表達載體；構建

抗生素作為飼料添加劑添加到畜禽日糧中能夠促進動物生長、提高飼料轉化率及防治疾病等，但飼用抗生素的負面影響受到越來越多的關注，例如耐藥性、殘留甚至可能危害到人類健康。益生素、酶制劑、酸化劑、抗菌肽等抗生素替代品成為當今學者的研究熱點?？咕膩碓从谏矬w本身，具有相對分子質量小、性能穩(wěn)定及較強的廣譜抗菌能力等特點，其作為飼料添加劑應用于飼料中具有明顯的優(yōu)勢[1]。片球菌、鏈球菌、乳桿菌等屬的菌株在代謝過程中可以合成并分泌到環(huán)境中對致病菌以及腐敗菌具有抑制作用的殺菌蛋白或多肽，即乳酸菌素[2]。鏈球菌產生的乳鏈菌肽對革蘭氏陽性菌有抗性，因其理化性質穩(wěn)定且無毒副作用，作為食品添加劑獲得FAO/WHO食品添加劑聯合委員會的認可[3]。與用于工業(yè)生產的乳鏈菌肽相比，乳酸片球菌來源的乳酸片球菌素對革蘭氏陽性菌也有抑菌活性，能有效殺死病原菌，尤其能抑制單核細胞增多癥李氏桿菌的生長[4]。韓燁等將乳酸片球菌素Ped-A基因克隆到pET-28a中，經誘導在大腸桿菌中表達，表達產物對單核細胞增多癥李氏桿菌有抗菌作用[5]。目前，已經開發(fā)出商品化的乳酸片球菌素Ped-A，可延長食品的保鮮期，并且能顯著抑制肉制品中李氏桿菌的生長[6]。隨著世界人口的劇增，減少糧食損失與浪費是提高全球糧食安全與實現環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的一個重要體現。利用生物防腐劑和生物防治技術可以延長食品、飲料或飼料的貯藏時間和安全性，并且不改變其感官特性[7]。本文將乳酸片球菌素Ped-A基因克隆到乳酸菌表達載體，對今后利用重組乳酸菌表達、純化乳酸片球菌素，從而為獲得具有抑菌活性的乳酸片球菌素提供了參考依據，為乳酸片球菌素作為防腐劑的開發(fā)奠定理論和技術基礎。

1　材料和方法

1.1試驗材料

大腸桿菌DH5α為TaKaRa公司產品，大腸桿菌DHB4為山東農業(yè)大學王曉云教授惠贈；pMG36e和pNZ8048為山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院基因工程研究室保存；dNTP、EasyTaq DNA聚合酶、EasyPfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；T4DNA連接酶、限制性內切酶XbaⅠ和HindⅢ購自TaKaRa公司；DL2000 DNA Mark?er、DL5000 DNA Marker、DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；質粒小量快速提取試劑盒購自OMEGA公司；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2試驗方法

1.2.1 Ped-A基因合成

根據NCBI公布的基因序列，將乳酸片球菌素Ped-A基因全長（189 bp）及不含信號肽的序列（135 bp）上下游分別添加XbaⅠ和HindⅢ酶切位點，委托TaKaRa公司合成，同時根據目的基因序列設計引物PED1、PED2、PED3，引物PED1/PED3對應于全長基因，引物PED2/ PED3對應于不含信號肽的序列。根據載體pMG36e、pNZ8048序列分別設計引物PMG1/ PMG2、PNZ1/ PNZ2，各引物序列見表1，均由濟南博尚公司合成。

表1　引物序列

將TaKaRa合成產物pMD18-T/Ped-A（全長/片段）活化培養(yǎng)后收集菌液，提取質粒，使用XbaⅠ和HindⅢ分別進行單酶切、雙酶初步鑒定。DNA序列分析由濟南博尚公司完成（使用pMD18-T載體通用測序引物），使用DNAMAN軟件將測序結果與理論序列比對。

1.2.2重組質粒pMG36e/Ped-A（全長/片段）和pNZ8048/Ped-A（全長/片段）的構建

1.2.2.1酶切、連接和轉化

提取pMD18-T/Ped-A（全長/片段）、pMG36e和pNZ8048質粒，均用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切，膠回收后，16℃連接過夜。連接產物pMG36e/Ped-A（全長/片段）和pNZ8048/Ped-A（全長/片段）分別轉化DH5α和DHB4感受態(tài)細胞，加連接產物5 μL與感受態(tài)細胞50 μL混合，冰浴30 min，42℃熱激60 s，加LB培養(yǎng)基900 μL，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，8 000 rpm離心收集菌體2 min，棄部分上清，懸浮菌體，取全部菌液涂LB平板（分別添加紅霉素200 μg·mL-1和氯霉素7.5 μg·mL-1）。

1.2.2.2陽性克隆的篩選

菌液PCR篩選pMG36e/Ped-A（全長/片段）陽性克隆，所用引物為載體引物PMG1/PMG2。PCR條件為94℃，5 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min 20 s（擴增30個循環(huán)）；72℃，6 min。

菌液PCR篩選pNZ8048/Ped-A（全長/片段）陽性克隆，所用引物為載體引物PNZ1/ PNZ2。PCR條件為94℃，5 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，1 min 40 s（擴增30個循環(huán)）；72℃，5 min。

擴增產物用1% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2.3重組質粒的酶切鑒定及DNA序列分析

選取篩選出的陽性重組菌擴大培養(yǎng)，提取質粒，使用XbaⅠ和HindⅢ酶切初步鑒定重組子。將提取出的重組質粒pMG36e/Ped-A（全長/片段）和pNZ8048/Ped-A（全長/片段）送濟南博尚公司測序。

2　結果與分析

2.1 pMD18-T/Ped-A（全長/片段）酶切鑒定及測序

pMD18-T/Ped-A（全長/片段）XbaⅠ和HindⅢ酶切鑒定電泳圖見圖1，PMD18-T/Ped-A（全長/片段）XbaⅠ和HindⅢ雙切酶鑒定電泳圖見圖2。

將TaKaRa合成產物活化培養(yǎng)后收集菌液，提取質粒，使用XbaⅠ和HindⅢ分別進行單酶切及雙酶切驗證，結果見圖1、2。單酶切后所得片段的大小約3 kb，與理論值一致；雙酶切結果中，目的基因條帶大小合適。將TaKaRa公司合成產物pMD18-T/Ped-A（全長/片段）送濟南博尚公司測序（使用pMD18-T載體通用測序引物），測序結果顯示，合成的序列完全正確。

圖1　 pMD18-T/Ped-A（全長/片段）XbaⅠ和HindⅢ酶切鑒定電泳圖

2.2重組質粒pMD18-T/Ped-A（全長/片段）陽性克隆的菌液PCR篩選結果

pMG36e/Ped-A（全長/片段）菌液PCR（引物PMG1/PMG2）篩選電泳圖見圖3。

使用T4DNA連接酶將回收的目的基因與載體片段進行連接，連接產物轉化DH5α。使用載體引物PMG1/PMG2進行菌液PCR篩選陽性克隆，產物用1% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3，所得目的條帶大小正確，篩選到多個陽性克隆。

圖2　 pMD18-T/Ped-A（全長/片段）XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定電泳圖

圖3　 pMG36e/Ped-A（全長/片段）菌液PCR（引物PMG1/PMG2）篩選電泳圖

2.3重組質粒pMG36e/Ped-A（全長/片段）的酶切鑒定及測序

pMG36e/Ped-A（全長/片段）重組質粒電泳圖見圖4。

圖4　 pMG36e/Ped-A（全長/片段）重組質粒電泳圖

使用OMEGA質粒提取試劑盒提取質粒，電泳檢測，質粒大小正確，見圖4；37℃條件下使用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切3 h后電泳檢測，在相應位置出現條帶，表明pMG36e/Ped-A（全長/片段）構建成功，結果見圖5。將重組質粒送濟南博尚公司測序，對測序結果進行比對，證實表達載體pMG36e/ Ped-A（全長/片段）構建成功。

2.4重組質粒pMG36e/Ped-A（全長/片段）陽性克隆的菌液PCR篩選結果

pNZ8048/Ped-A（全長）菌液PCR篩選電泳圖見圖6。pNZ8048/Ped-A（片段）菌液PCR篩選電泳圖見圖7。

使用T4DNA Ligase將回收的目的基因與載體片段進行連接，連接產物轉化DHB4，使用載體引物PNZ1/PNZ2進行菌液PCR篩選，擴增產物用1% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖6、7，由圖可以看出，成功篩選到多個陽性轉化子。

2.5重組質粒pNZ8048/Ped-A（全長/片段）酶切鑒定

重組質粒pNZ8048/Ped-A（全長/片段）電泳圖見圖8。重組質粒pNZ8048/Ped-A（全長/片段）酶切鑒定電泳圖見圖9。

使用OMEGA質粒提取試劑盒提取質粒，電泳檢測，如圖8所示；37℃條件下使用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切3.5 h后電泳檢測，結果見圖9。將提取出的重組質粒送濟南博尚公司測序，測序結果證實表達載體pNZ8048/Ped-A（全長/片段）構建成功。

圖5　 pMG36e/Ped-A（全長/片段）重組質粒電泳圖

圖6　 pNZ8048/Ped-A全長的菌液PCR篩選電泳圖

圖7　 pNZ8048/Ped-A（片段）菌液PCR篩選電泳圖

圖8　重組質粒pNZ8048/Ped-A（全長/片段）電泳圖

圖9　重組質粒pNZ8048/Ped-A（全長/片段）酶切鑒定電泳圖

3　討論

在食物及飼料保存中，傳統(tǒng)的化學防腐劑可以解決由微生物引起的腐敗和疾病，但防腐劑的濫用又造成了一系列的安全問題。乳酸片球菌素具有天然安全、無毒副作用及耐熱耐酸的特性，因而作為可食用級別防腐劑具有良好的應用前景[8]。野生乳酸片球菌素產量低、分離純化技術不成熟，純化產物得率和純度不能兩全，這些問題是乳酸片球菌素實現規(guī)?；a和應用的瓶頸[9]。近些年大量研究嘗試利用蛋白質工程、基因工程方法獲得更高活性的細菌素[10]。異源表達可以提高乳酸片球菌素的產量，目前多用大腸桿菌表達系統(tǒng)、酵母菌表達系統(tǒng)和乳酸菌表達系統(tǒng)表達片球菌素[11-12]。雖然以大腸桿菌為宿主可以實現乳酸片球菌素的高效表達和具有易于純化的特點，但將其表達的乳酸片球菌素作為食品級防腐劑獲得許可并推廣應用存在爭議。乳酸菌是人和動物腸道內的常見細菌，因其不具有致病性，被公認為安全級微生物，并且在青貯飼料發(fā)酵中起主要作用，是一類數量和種類最多的微生物。因此，利用乳酸菌作為片球菌素異源高效表達的宿主表達菌成為具有前景的選擇。

4　結論

本研究將Ped-A基因成功克隆到乳酸菌表達載體pNZ8048和pMG36e，積累了乳酸菌表達載體的構建，為食品級乳酸菌高效表達系統(tǒng)的開發(fā)利用打下堅實的基礎。

[參考文獻]

[1]李鵬,齊廣海.飼料添加劑中常用的抗生素替代品[J].飼料博覽, 2006（8）: 24-26.

[2] Kaur G, Singh T P, Malik R K. Antibacterial efficacy of nisin, Pediocin34 and enterocin FH99 against listeria monocytogenes and cross resistance of its bacteriocin resistant variants to common food preservatives[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2013, 44 （1）: 63-71.

[3]劉文營,王飛,趙維高,等.乳鏈菌肽抗菌應用研究[J].中國釀造, 2012, 31（9）: 5-9.

[4] Reviriego C, Femn N A, Horn N, et al. Production of pediocin PA-1, and coproduction of nisin A and pediocin PA-1, by wild Lactococcuslactis strains of dairy origin[J]. International Dairy Journal, 2005, 15（1）: 45-49.

[5]韓燁,周志江,王培培,等.片球菌素基因的克隆及表達[J].華北農學報, 2009, 24（2）: 32-35.

[6]劉晨,齊凡,陳穎怡,等.片球菌素在食品防腐保鮮中的應用研究進展[J].保鮮與加工, 2012, 12（4）: 1-6.

[7] Goodridge L D, Bisha B. Phage-based biocontrol strategies to re?duce foodborne pathogens in foods[J]. Bacteriophage, 2011, 1（3）: 130-137.

[8]呂燕妮.廣譜抗菌肽——片球菌素pediocin PA-1[J].食品科技, 2011, 36（9）: 41-44.

[9]劉晨,安超,李飛,等.片球菌素的純化及穩(wěn)定性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè). 2012, 38（6）: 33-37.

[10] Willem M de Vos. Gene expression systems for lactic acid bacteria [J]. Current Opinion in Microbiology, 1999, 2（3）: 289-295.

[11]余占橋,楊芳,張日俊.細菌素異源表達的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37（2）: 51-54.

[11]余占橋,楊芳,張日俊.細菌素異源表達的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37（2）: 51-54.

[12] Altena K, Guder A, Cramer C, Bierbaum G, et al. Biosynthesis of the lantibiotic mersacidin: organization of a type B lantibiotic gene cluster[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66（6）: 2 565-2 571.

Construction of Expression Vectors for Lactic Acid Pediocin Ped-A

MU Xijun, LIU Xiuxia, XU Yanxia, SUN Xuesen, GU Wei
（Shandong Baolai-Leelai Bio-Industrial Co., Ltd., Taian 271000, Shandong China）

Abstract:Lactic acid pediocin can be used as a preservative to extend the shelf life of food. The full gene se?quence of Ped-Aand without signal peptide were inserted into expression vectors pMG36e and pNZ8048. By using re?striction enzyme and sequence analysis, it can be proved that recombinant plasmids pMG36e/Ped-A(full length/ frag?ment) and pNZ8048/Ped-A(full length / fragment) were transformed into E. coli DH5α and DHB4 successfully. The result confirmed that Ped-Agene expressionvectors were constructed successfully.

Key words:pediocin Ped-Agene; lactobacillus expression vector; construction

作者簡介：穆熙軍（1982-），男，山東泰安人，碩士，助理研究員，主要從事基因工程技術在微生態(tài)制劑應用的研究。

收稿日期：2014-10-05

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1001-0084（2015）02-0001-05