蕨麻小型豬與巴馬小型豬高原多臟器功能障礙綜合征模型的比較研究

牛廷獻(xiàn)，郭曉宇，申 健，王紅義，陸 璐，肖 攀，馮小明

（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院，蘭州 730050）

蕨麻小型豬與巴馬小型豬高原多臟器功能障礙綜合征模型的比較研究

牛廷獻(xiàn)，郭曉宇，申 健，王紅義，陸 璐，肖 攀，馮小明

（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院，蘭州 730050）

目的 比較不同海拔地區(qū)兩種小型豬高原多臟器功能障礙綜合征（H-MODS）模型存在的差異，探討建立H-MODS模型的理想動物。方法 利用高原土生蕨麻小型豬與平原巴馬小型豬，以內(nèi)毒素（LPS）建立HMODS模型。檢測不同時點血液生理生化指標(biāo)的變化，并觀察肺臟組織病理學(xué)變化。結(jié)果 巴馬小型豬模型的死亡率明顯高于蕨麻小型豬；生理生化各指標(biāo)的變化基本相同，但蕨麻小型豬的變化較平緩。在24 h與48 h肺臟均出現(xiàn)嚴(yán)重病理改變，但巴馬小型豬較蕨麻小型豬更嚴(yán)重。結(jié)論 不同海拔地區(qū)的兩種小型豬均可成功建立HMODS模型，同時蕨麻小型豬由于自身高原生物特性對H-MODS模型的復(fù)制更加準(zhǔn)確安全，避免高原環(huán)境的外在因素的影響。

高原多臟器功能障礙綜合征模型；蕨麻小型豬；巴馬小型豬；比較

我國高原地區(qū)急性重型高原病并發(fā)多臟器功能障礙綜合征（multiorgan dysfunction syndrome，MODS）的發(fā)病率較高［1，2］。高原地區(qū)發(fā)生 MODS（H-MODS）后雖然在本質(zhì)上與平原MODS沒有差別，但從平原進(jìn)駐高原后隨著海拔高度的上升，以缺氧的環(huán)境因素逐漸成為主要影響因素。從而不同程度地改變了MODS的發(fā)病過程、臨床特征和預(yù)后，使其治療方案也隨之發(fā)生了顯著變化［3］。而HMODS在治療中的不確定因素比平原地區(qū)更多、變數(shù)更大，使得難以全面細(xì)致觀察H-MODS患者病情變化的全過程。H-MODS動物模型是研究其發(fā)病機(jī)制和臨床防治的基礎(chǔ)，但目前研究所使用的實驗動物均為低海拔或中度海拔生長培育的［4-7］，不具有高原生物學(xué)特性。在建立高原疾病模型時，不同海拔地區(qū)的動物對所建模型的質(zhì)量是否存在差異未見報道。而在研究中低海拔地區(qū)生長的實驗動物自身會出現(xiàn)不同程度的高原反應(yīng)，受高原環(huán)境的外在因素的影響很大，這就難免使得實驗結(jié)果出現(xiàn)一些誤差。對此，本研究采用高原蕨麻小型豬和巴馬小型豬建立H-MODS模型，以研究二者對模型質(zhì)量存在的差異，尋求建立H-MODS模型理想的實驗動物。

1 材料和方法

1.1 動物與試劑

蕨麻小型豬與巴馬小型豬各6只，雌雄各半，體重15 kg左右，分為蕨麻小型豬（JM）組和巴馬小型豬（BM）組。蕨麻小型豬為蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗科培育，巴馬小型豬購自第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心（生產(chǎn)許可證：SCXK（軍）2012-006）。氯胺酮（國藥準(zhǔn)字：H35020148，福建古田藥業(yè)有限公司），地西泮注射液（國藥準(zhǔn)字：H12020957，天津金耀氨基酸有限公司），LPS（血清型為：O127：B8，批號為64H4010，美國Sigma公司）。生化分析儀：Beckman公司，Coulter LX20。

1.2 模型建立

制模方法參照文獻(xiàn)［4，8］，本實驗在海拔3500 m的甘南?？撇菰M(jìn)行，將豬運(yùn)輸?shù)侥康牡刂螅菡? d待動物的狀態(tài)穩(wěn)定之后再進(jìn)行實驗。JM和BM均采用氯胺酮（6 mg/kg）聯(lián)合安定（0.5 mg/kg）進(jìn)行肌內(nèi)注射麻醉，同時肌內(nèi)注射阿托品（0.05 mg/kg）。兩組豬麻醉后經(jīng)耳靜脈泵入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（0.35 mg/kg，30 min內(nèi)泵完）。

1.3 血常規(guī)和血清生化指標(biāo)的測定

血常規(guī)及各項生化指標(biāo)的檢測均由本院檢驗科完成。分別于0、3、6、12、24、48和72 h經(jīng)頸靜脈采血，測定血液血常規(guī)：紅細(xì)胞計數(shù)（RBC）、白細(xì)胞計數(shù)（WBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞積壓（HCT）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量（MCH）、血小板（PLT）等和血清生化指標(biāo)：肌酸激酶（CK）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）和肌酐（CRE）。

1.4MODS的診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照胡森等［8，9］提出的動物發(fā)生MODS時各個器官功能障礙分期診斷標(biāo)準(zhǔn)和評分標(biāo)準(zhǔn)。在注射LPS后出現(xiàn)2個或2個以上器官或系統(tǒng)功能障礙判定為MODS。1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體征表現(xiàn)

JM組豬麻醉后由耳靜脈泵入LPS，30 min內(nèi)輸完，1 h后JM豬開始轉(zhuǎn)醒但是倒臥不起，呼吸及心率增快，并出現(xiàn)腹脹、發(fā)熱、尿頻；蘇醒后四肢無力倒臥，無食欲，精神萎靡，呼吸急促；8～10 h后JM組豬站立行走，開始采食，精神狀態(tài)良好，基本恢復(fù)正常；其中1頭JM組豬在4 h因呼吸窘迫、心律、繼之心衰死亡。BM組豬的體征表現(xiàn)與JM組相比出同樣癥狀但更嚴(yán)重；BM組豬麻醉并在30 min內(nèi)輸完LPS，1 h后還處于昏迷狀態(tài)，2 h后開始轉(zhuǎn)醒但倒臥不起，呼吸及心率增快，并出現(xiàn)腹脹、發(fā)熱、尿頻，無食欲，精神萎靡；5 h與14 h分別有1只豬出現(xiàn)死亡；12～16 h后JM組豬站立行走，開始采食，精神狀態(tài)良好，基本恢復(fù)正常。JM組與BM組豬死亡率分別為16.7％和33.3％。

2.2 生化水平比較

蕨麻小型豬與巴馬小型豬生化水平比較結(jié)果見圖1。其CK、AST變化趨勢兩者是相同的，0 h～6 h急劇上升，12 h～24 h達(dá)到最大，之后又開始下降至72 h基本恢復(fù)正常，兩者的表達(dá)水平也是非常的相近（見圖1-1，1-2）。JM組ALT在48h后略呈下降趨勢，BM組變化趨與水平（見圖1-3）；BM組TBIL水平在0h高于JM組并一直上升，24 h達(dá)到最大，24～48 h急劇下降；JM組水平低于BM組，0 h～12 h其變化基本趨于水平，12 h～48 h與BM組相同具有先升高后降低的趨勢，但是變化幅度很?。ㄒ妶D1-4）。BM組CRE水平高于JM組，且在0 h～3 h略有降低，在3 h～12 h開始上升，之后緩慢降低；JM組水平變化平緩并趨于水平（見圖1-5）。

2.3 血常規(guī)水平比較

蕨麻小型豬與巴馬小型豬血常規(guī)水平比較結(jié)果見圖2。兩者WBC、RBC、PLT變化趨勢是相同的，WBC在0 h～3h急劇下降，6 h～24h急劇上升，24 h～72h又開始下降（見圖2-1）；RBC在0 h～3 h基本沒有變化，在3 h～6h上升，6 h～24 h下降，24 h～72 h又開始上升（見圖2-2）；PLT水平變化趨勢是先下降后升高（見圖2-3）。盡管兩者WBC、RBC、PLT變化趨勢是相同，但是JM組變化幅度較BM組相對平緩，此外WBC與RBC水平JM組在0 h要高于BM組，但是0 h PLT水平BM組高于JM組。其余血常規(guī)指標(biāo)兩者之間沒有明顯的區(qū)別。

2.4 肺組織病理變化比較

圖1 蕨麻小型豬與巴馬小型豬生化指標(biāo)變化比較Fig.1 Changes of biochemistry in the Juema minipig and Bama minipig.

圖2 蕨麻小型豬與巴馬小型豬生化指標(biāo)變化比較Fig.2 Changes of blood WBC，RBC and PLT in the Juema minipig and Bama minipig.

巴馬小型豬與蕨麻小型豬24 h（A、B）、48 h（C、D）及正常對照（E、F）肺組織病理切片如圖3所示。A肺泡腔無滲出，均勻一致，支氣管腔完整，肺泡上皮細(xì)胞排列整齊，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，有少量紅細(xì)胞滲出；B肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，毛細(xì)血管無擴(kuò)張，無水腫，無紅細(xì)胞擁堵現(xiàn)象，肺泡間隔增寬，部分肺泡上皮細(xì)胞排列雜亂。C肺泡腔內(nèi)彌散性淤血，有大量紅細(xì)胞滲出及少量中性粒細(xì)胞浸潤，巨噬細(xì)胞增多，肺泡間隔增寬，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；D肺泡腔內(nèi)有輕微出血，肺泡壁模糊，有少量紅細(xì)胞滲出，肺泡間隔略有增厚。E和F肺組織結(jié)構(gòu)未見異常改變（圖3封二）。

3 討論

高原蕨麻小型豬生長于我國青藏高原甘南藏族自治州合作地區(qū)。由于生存在惡劣高寒氣候和低劣的飼養(yǎng)條件下，使其具有適應(yīng)高原環(huán)境的獨特的生物學(xué)特性。并且長期以來在封閉環(huán)境中自繁自養(yǎng)免受外來血緣的雜交影響，從而它形成了一個穩(wěn)定的原始的地方小型豬種。它生長緩慢、體形矮小、繁殖能力強(qiáng)，是典型的高原小型豬種之一［10］。在高原地區(qū)，伴隨著海拔的增高，低氧、低壓環(huán)境等影響因素也在加強(qiáng)，促使MODS發(fā)生發(fā)展也急驟加快，因而選擇合適的動物建立模型，可以更準(zhǔn)確的了解高海拔地區(qū)MODS的演變規(guī)律，病理變化特點，對高海拔地區(qū)MODS早期診斷、早期治療提供重要的參考依據(jù)。本研究采用高原土生蕨麻小型豬和巴馬小型豬建立H-MODS模型進(jìn)行對比分析，研究高原醫(yī)學(xué)與實驗動物的高原特性之間關(guān)系。

在MODS的研究中，采用大小鼠、兔及大型動物如綿羊和犬等均可用于建立MODS模型［11-13］，大、小鼠對內(nèi)毒素敏感性較差，解剖結(jié)構(gòu)與人差別較大，不是理想的模型動物；兔雖然對內(nèi)毒素敏感性好，但死亡率很高；而小型豬在疾病發(fā)病機(jī)理、生理學(xué)、解剖學(xué)等方面與人相似度很高，從而成為研究人類疾病理想的實驗動物［14-18］，利用小型豬建立MODS模型能夠更加真實地模擬病理變化和臨床特征。

本研究選擇具有高原特性的蕨麻小型豬與巴馬小型豬在相同條件下建立高原MODS動物模型，兩者均可以在小劑量LPS作用下就能形成全身性炎癥反應(yīng)（SIRS），繼而誘發(fā)MODS［19］。兩者建模后CK、AST變化趨勢兩者是相同的，先急劇增高然后再下降至72h基本恢復(fù)正常，兩者 ALT、TBIL及CRE變化基本相同，并且兩者的表達(dá)水平也是非常的相近，但是TBIL和CRE的變化趨勢蕨麻豬較小型豬平緩一點。WBC在0～3 h急劇下降，6 h～24h急劇上升，24 h～72 h又開始下降，與綿羊高原MODS模型的變化規(guī)律完全吻合［20］，雖然兩者WBC、RBC、PLT變化趨勢相同，但是JM組變化幅度較BM組相對平緩。

研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素繼發(fā)的全身炎癥在高海拔地區(qū)反應(yīng)明顯比低海拔地區(qū)嚴(yán)重，同時高原地區(qū)MODS所引起的死亡率［21］、肺部損傷病理改變也比亞高原地區(qū)明顯嚴(yán)重［5］。本研究采用平原動物與高原地區(qū)動物分別建立高原MODS模型都引起嚴(yán)重的肺部損傷，在48 h肺部病理變化最為嚴(yán)重，肺臟均出現(xiàn)不同程度的充血水腫，肺泡腔內(nèi)淤血，紅細(xì)胞滲出，肺泡間隔略有增厚等明顯的病理特征，但是蕨麻小型豬的病理變化較巴馬小型豬略微小，而且兩組死亡率蕨麻小型豬明顯低于巴馬小型豬。這可能與高原MODS中性粒細(xì)胞在低氧環(huán)境暴露下功能改變密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)在急性缺氧環(huán)境下中性粒細(xì)胞趨化能力加劇，體現(xiàn)在常氧對照組中性粒細(xì)胞偽足長度小于急慢性缺氧組［22］。同時，在高海拔地區(qū)，由于低氧應(yīng)激因素的存在，MODS模型表現(xiàn)出病理損傷較中度海拔地區(qū)嚴(yán)重，然而在主要的損傷器官中，肺損傷尤其明顯，可能是在LPS誘導(dǎo)的MODS發(fā)生發(fā)展中，伴隨著早期炎癥介質(zhì)大量釋放而引起肺泡毛細(xì)管膜過渡炎癥反應(yīng)。有研究報道，在相同內(nèi)毒素劑量誘導(dǎo)下，高海拔地區(qū)建立動物模型時所引起機(jī)體的病理損傷比中度海拔地區(qū)嚴(yán)重，這就反應(yīng)了外在的低氧環(huán)境可能會推動病情的發(fā)展［5］。

因此，在建立高原疾病模型實驗動物的選擇中，由于不同的實驗動物具有不同的生物學(xué)特性，對于高原低氧環(huán)境的適應(yīng)能力不同，所以在建立疾病模型時，非高原性實驗動物受高原低氧環(huán)境的影響更大。這也就提示在高原疾病的研究中選用高原特性實驗動物將更準(zhǔn)確的模擬疾病發(fā)生發(fā)展特點的同時可避免外在的打擊因素而引起的死亡。

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Comparison of the Bama minipig and Juema minipig models of high altitude multi-organ dysfunction syndrome

NIU Ting-xian，GUO Xiao-yu，SHEN Jian，WANG Hong-yi，LU Lu，XIAO Pan，F(xiàn)ENG Xiao-ming
（Department of Animal Experiment，Lanzhou General Hospital of PLA Lanzhou Military Command，Lanzhou 730050，China）

Objective To compare the Bama minipig and Juema minipig models of high altitude multi-organ dysfunction syndrome.Methods Six plateau-origin Juema minipigs and plain-origin Bama minpigs in each group

intravenous infusion of 0.35 mg/kg lipopolysaccharide（LPS），respectively.Blood samples were taken at 0 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h and 72 h after LPS infusion.Routine blood test was performed，blood CK，AST，ALT，TBIL，CRE were assayed，and histopathological examination of the lung tissues was performed at 24 h，48 h after LPS infusion.Results The mortality of Bama minipigs was 33.3％，higher than that of 16.7％of Juema minipigs.The trend of physiological and biochemical changes was similar，but was milder in the Juema minipigs than in Bama minipigs.The lung injuries of the Bama minipigs at 24 h and 48 h were more severe than those in the Juema minipigs.Conclusions Both Bama and Juema minipig models of high altitude multi-organ dysfunction syndrome can be successfully established.Juema minipig models can be more closely and safely established，due to its own plateau biological properties，and avoid the influence by extrinsicinjurious effects of plateau environment.

High altitude multi-organ dysfunction syndrome；Juema minipig；Bama minipig；Animal model

R33

A

1671-7856（2015）04-0033-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.007

甘肅省技術(shù)研究與開發(fā)專項計劃（1205TCYA010）。

牛廷獻(xiàn)（1966-），男，主任技師，主要研究方向：人類疾病動物模型的建立及相關(guān)研究。E-mail：niutx10000@163.com。

馮小明（1980-），男，主管技師，主要研究方向：實驗動物質(zhì)量控制及開發(fā)研究。Email：fxm8006@163.com。

2015-02-09