17β雌二醇對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的保護作用

王 迅，冷曉磊，矯永慶，崔 鵬

（1.大連市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧，大連 116033；2.大連醫(yī)科大學附屬三院神經(jīng)外科，遼寧，大連 116000）

17β雌二醇對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的保護作用

王 迅1，冷曉磊1，矯永慶1，崔 鵬2

（1.大連市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧，大連 116033；2.大連醫(yī)科大學附屬三院神經(jīng)外科，遼寧，大連 116000）

目的探討大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后17β雌二醇對腦組織的保護作用。方法 選擇雄性成年 SD大鼠45只，按隨機數(shù)字表法分為三組，每組15只：對照組僅開骨窗，不損傷腦組織；致傷組制大鼠自由落體腦撞擊傷模型；處理組在致傷組的基礎上，傷前1周腹腔注射17β雌二醇溶液（1 mg/kg），1次/d。余兩組僅注射同體積的蓖麻油。在傷后6 h、24 h及48 h測量各組腦組織含水量、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性。結果致傷組和處理組在傷后6 h、24 h、48 h三個時間點腦組織含水量均高于對照組（P＜0.05）。在傷后6 h，致傷組和處理組腦組織含水量比較差異無統(tǒng)計學意義［（58.39±0.29）％比（57.03±0.27）％］（P＞0.05），而在傷后24 h、48 h致傷組腦組織含水量明顯高于處理組，差異有統(tǒng)計學意義［（67.41±0.37）％比（64.77±0.33）％，（81.95 ±0.47）％比（75.26±0.41）％］（P＜0.05）。在傷后6 h致傷組、處理組MDA含量明顯增加，并且一直維持在較高水平，而SOD活性則明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。處理組在傷后6 h MDA含量和SOD活性與致傷組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而在傷后24 h、48 h MDA含量顯著降低［（130.39±7.02）μmol/g比（149.41±8.25）μmol/g，（125.41±6.59）μmol/g比（157.72±8.93）μmol/g］，SOD活性則明顯增高［（88.46±7.17）U/g比（80.10±4.87）U/g，（97.31±7.89）U/g比（84.29±6.13）U/g］，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 17β雌二醇對創(chuàng)傷性腦損傷有保護作用。

雌二醇；腦損傷；丙二醛；超氧化物歧化酶；腦組織含水量；大鼠

顱腦損傷是當今威脅人類生命的主要疾患之一，其發(fā)生率和病死率僅次于癌癥和心血管疾病而居第三位，在暴力性死亡中顱腦損傷的病死率居首位。雌激素作為一種內(nèi)源性激素在全身多個系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，其中神經(jīng)系統(tǒng)也是其靶器官［1］。本研究旨在探討17β雌二醇對創(chuàng)傷性腦損傷的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取健康雄性SD大鼠45只，7～8周齡，體重220 g～250 g，由遼寧醫(yī)學院動物實驗中心提供（生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2013-0007）。按隨機數(shù)字表法分為對照組、致傷組和處理組，每組15只。使用許可證號：（SYXK（遼）2003-0019）。

1.2 儀器與試劑

17β雌二醇粉劑（美國 Sigma公司）。TA1300電子天平（精確到0.01，上海皓莊儀器有限公司），用于腦含水量測量；超聲波細胞粉碎機（北京中科科爾儀器有限公司）、離心機（北京京立離心機有限公司）、紅外線干燥箱（北京卓川電子科技有限公司），用于制成組織勻漿液及提取上清液，待用于SOD及MDA測定。SOD試劑盒、MDA試劑盒（購于南京建成生化有限公司）。

1.3 動物實驗方法

1.3.1 動物模型制作：致傷組及處理組均采用改進的Feeney自由落體硬膜外撞擊方法［2］：將SD大鼠稱重后經(jīng)10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g體重），俯臥固定于腦立體定位儀上。矢狀中線切開頭皮后分離骨膜，暴露前囟、冠狀縫、矢狀縫及頂骨。以前囟后3.0 mm，向右旁開矢狀縫3.0 mm為中心作一直徑約為4～5 mm顱骨鉆孔。保持硬腦膜不受損傷。將自由落體裝置底座置于右頂骨窗部的硬腦膜表面，以25 g重物自40 cm高沿套管下落打擊致傷底座，其直徑3.5 mm，最大下陷距離3.0 mm，硬膜保持完整，造成右頂局限性損傷。對照組僅開骨窗，不損傷腦組織。用牙托粉封閉骨窗，縫合頭皮，置鼠籠喂養(yǎng)。

1.3.2 給藥途徑及方法：處理組于傷前1周腹腔注射17β雌二醇溶液（1 mg/kg），1次/d，余兩組僅注射同體積的蓖麻油。

1.3.3 標本處理及采集：各組在傷后6 h、24 h及48 h相應時間點分別取5只大鼠進行處理。采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g），斷頭處死，在冰盤上快速取全腦，00C PBS緩沖液清洗，濾紙吸干備用。

1.4 觀察指標

1.4.1 腦組織含水量測定：致傷組及處理組均取傷灶周圍腦組織，對照組取對應部位腦組織，使用電子分析天平分別稱取腦濕重100 mg，然后將標本置于90℃紅外線干燥箱中24～48 h至恒重，稱取值為干重。腦組織含水量用濕重的百分比表示，采用Eliot公式計算即腦組織含水量（％）=（濕重 -干重）/濕重 ×100％。

1.4.2 腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量測定：將采集的全腦標本于冰浴中迅速分離腦組織，取損傷側半球腦組織稱重，按1∶10比例（每1 g組織加10 mL生理鹽水）加入冰生理鹽水，用組織勻漿機分別制成10％組織勻漿，離心10 min，并用生理鹽水將上清液稀釋成1％組織勻漿。根據(jù)SOD試劑盒說明、MDA試劑盒說明進行測定SOD活性及MDA含量。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行分析，正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組傷后不同時間點腦組織含水量比較

致傷組和處理組在傷后6 h、24 h、48 h三個時間點腦組織含水量均高于對照組（P＜0.05）。在傷后6 h，致傷組和處理組腦組織含水量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而在傷后24 h、48 h致傷組腦組織含水量明顯高于處理組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 三組傷后不同時間點MDA含量及SOD活性變化

在傷后6 h致傷組、處理組 MDA含量明顯增加，并且一直維持在較高水平，而SOD活性則明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。處理組在傷后6 h MDA含量和SOD活性與致傷組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而在傷后24 h、48 h MDA含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

表1 三組SD大鼠傷后不同時間點腦組織含水量比較（％，±s）Tab.1 Comparison of the brain tissue water content in the rats of three groups at different time points after injury（％，±s）

表1 三組SD大鼠傷后不同時間點腦組織含水量比較（％，±s）Tab.1 Comparison of the brain tissue water content in the rats of three groups at different time points after injury（％，±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與致傷組比較，bP＜0.05Note.aP＜0.05 compared with the control group；bP＜0.05 compared with the injury group.

組別Groups例數(shù)Cases傷后6 h（5例）6 h after injury（5 cases）傷后24h（5例）24 h after injury（5 cases）傷后48h（5例）48 h after injury（5 cases）對照組Control 15 53.67±0.21 53.28±0.22 53.89±0.24致傷組Injury 15 58.39±0.29a 67.41±0.37a 81.95±0.47a處理組Treatment 15 57.03±0.27a 64.77±0.33ab 75.26±0.41ab

表2 三組傷后不同時間點MDA含量及SOD活性變化（±s）Tab.2 Changes of MDA content and SOD activity in the brain tissue in the rats of three groups at different time points（±s）

表2 三組傷后不同時間點MDA含量及SOD活性變化（±s）Tab.2 Changes of MDA content and SOD activity in the brain tissue in the rats of three groups at different time points（±s）

注：與對照組相同時間點比較，aP＜0.05，與致傷組相同時間點比較，bP＜0.05Note.Compared with the control group at the same time point，aP＜0.05；compared with the injury group at the same time point，bP＜0.05.

組別Groups例數(shù)Cases丙二醛（MDA）含量（μmol/g）MDA content（μmol/g）超氧化物歧化酶（SOD）活性（U/g）SOD activity（U/g）對照組Control 15傷后6 h 6 h after injury 5 116.55±5.92 120.35±4.43傷后24 h 24 h after injury 5 118.31±5.25 119.89±4.68傷后48 h 48 h after injury 5 117.47±6.17 121.44±5.04致傷組Injury group 15傷后6 h 6 h after injury 5 145.38±7.71a 79.99±5.21a傷后24 h 24 h after injury 5 149.41±8.25a 80.10±4.87a傷后48 h 48h after injury 5 157.72±8.93a 84.29±6.13a處理組Treatment group 15傷后6 h 6h after injury 5 144.42±7.49a 81.95±6.62a傷后24 h 24h after injury 5 130.39±7.02ab 88.46±7.17ab傷后48 h 48h after injury 5 125.41±6.59ab 97.31±7.89ab

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷后引起的出血、缺血及缺血再灌注等均伴有大量的氧自由基產(chǎn)生，由于細胞膜脂質(zhì)內(nèi)含有大量的膽固醇及多不飽和脂肪酸，易遭受自由基的侵害，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，致細胞膜通透性改變，細胞水腫壞死［3］。SOD是一種金屬酶，此酶可催化超氧自由基發(fā)生歧化反應，能夠清除氧自由基，保護生物膜免受自由基的傷害。自由基可使腦組織MDA含量升高，SOD活性下降。通過研究腦組織線粒體MDA和SOD水平的變化，可以反映藥物治療的效果是否通過對抗自由基而發(fā)揮其治療作用［4］。

雌激素是由雌激素合成酶催化雄激素轉化而來的，主要由卵巢分泌產(chǎn)生，胎盤、腎上腺皮質(zhì)和男性的睪丸也能產(chǎn)生少量的雌激素。本實驗選用的17β雌二醇是體內(nèi)含量最多、活性最強的，在臨床及實驗研究中大多都采用17β雌二醇，具有一定的代表性。

雌激素作為內(nèi)源性激素主要是通過作用于表達雌激素受體（estradiol receptor，ER）的靶器官來發(fā)揮其生理及藥理作用的［5］。ER在體內(nèi)分布廣泛，神經(jīng)系統(tǒng)也是雌激素的靶器官，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，ER存在于中間、感覺神經(jīng)元，膠質(zhì)細胞等。近來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)［6］，在多種腦損傷（缺血、興奮性氨基酸刺激、低糖）模型和多種培養(yǎng)細胞（初級神經(jīng)元、腫瘤源性的神經(jīng)細胞系、混合培養(yǎng)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞）上，都觀察到不同濃度的17β雌二醇能緩解神經(jīng)元的凋亡，發(fā)揮保護作用。其作用機理包括經(jīng)典的受體依賴機制和新的受體非依賴機制。而受體非依賴途徑包括改善血液循環(huán)、降低白細胞黏附、減少過氧化反應、抑制Ca2+內(nèi)流、減少一氧化氮的產(chǎn)生、減少谷氨酸的神經(jīng)毒性等［7］。本實驗結果表明，致傷組和處理組在傷后6、24、48 h三個時間點腦組織含水量均高于對照組（P＜0.05）。在傷后6 h，致傷組和處理組腦組織含水量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而在傷后24 h、48 h致傷組腦組織含水量明顯高于處理組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在傷后6 h致傷組、處理組MDA含量明顯增加，并且一直維持在較高水平，而SOD活性則明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。處理組在傷后6 h MDA含量和SOD活性的變化與致傷組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而在傷后24 h、48 h MDA含量顯著降低，SOD活性則明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義（ P＜0.05）。由此可見，17β雌二醇對大鼠腦創(chuàng)傷有保護作用，其作用機制可能通過減少脂質(zhì)過氧化，抑制自由基生成來發(fā)揮其保護作用。

［1］Asl SZ，Khaksari M，Khachki AS，et al.Contribution of estrogen receptors alpha and beta in the brain response to traumatic brain injury［J］.J Neurosurg，2013，119（2）：353-361.

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Protective effect of 17β-estradiol on traumatic brain injury in rats

WANG Xun1，LENG Xiao-lei1，JIAO Yong-qing1，CUI Peng2
（1.Department of Neurosurgery，the Third People’s Hospital of Dalian City，Dalian 116033，China；2.Department of Neurosurgery，Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116000）

Objective To explore the protective effect of 17β-estradiol on traumatic brain injury in rats.Methods A total of 45 adult male SD rats were divided into 3 groups using the random digit table，15 rats in each group：the control group only exposed but not injured the brain，the injury group

traumatic brain injury（TBI）by Feeney’s method，and the treatment group received the same handling with injury group，and pretreatment with 17β-estradiol peritoneal injection，1 mg/kg per day for one week.The other two groups were given the same volume of castor oil.At 6 h，24 h and 48 h after injury，the brain tissue water content，malondialdehyde（MDA）content and superoxide dismutase（SOD）activity were measured.Results At 6 h，24 h and 48 h after injury，the levels of brain tissue water content in the injury group and treatment group were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）.At 6 h after injury，the brain tissue water contents in the injury group and treatment group were（99.83±0.40）％and（99.53±0.41）％，respectively，with a non-significant difference between the two groups（P＞0.05）.At 24 h and 48 h after injury，the brain tissue water contents in the injury group was（105.17±0.43）％and（107.54±0.39）％，in the treatment group was（103.26±0.42）％and（105.89±0.43）％，respectively，showing a significant difference between the two groups（P＜0.05）.At 6 h after injury，the levels of MDA in the injury group and treatment group increased and maintained at a higher level，and the levels of SOD decreased.Compared with the control group，there had a significant difference（P＜0.05）.The levels of MDA and SOD in the injury group and treatment group at 6 h after injury had a non-significant difference（P＞0.05）.But at 24 h and 48 h after injury，the levels of MDA in the treatment group were significantly lower than those in the injury group［（130.39±7.02）μmol/g vs.（149.41±8.25）μmol/g，（125.41±6.59）μmol/g vs.（157.72± 8.93）μmol/L］，and the levels of SOD in the treatment group were significantly higher than thoset in the injury group［（88.46±7.17）U/g vs.（80.10±4.87）U/mg，（97.31±7.89）U/g vs.（84.29±6.13）U/g］，with a significant difference（P＜0.05）between the two groups.Conclusions 17β-estradiol has a protective effect on traumatic brain injury.

Estradiol；Brain injury，traumatic；Malondialdehyde；Superoxide dismutase；Brain water content；Rats

R33

A

1671-7856（2015）04-0023-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.005

王迅（1980-），男，研究方向：神經(jīng)外科基礎Email：fyw52512@sina.com。

崔鵬（1978-），男，研究方向：神經(jīng)外科基礎Email：wx626626@sina.com。

2015-02-02