痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血小型豬模型的建立

潘永明，陳 亮，徐孝平，朱科燕，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053）

痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血小型豬模型的建立

潘永明，陳 亮，徐孝平，朱科燕，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053）

目的采用高脂、靜脈注射維生素D3(VD3）和異丙腎上腺素建立痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血小型豬模型。方法 15只雄性巴馬小型豬隨機(jī)分成正常對(duì)照(Ctr）組、高脂(HFC）組和痰瘀互結(jié)證心肌缺血模型(CMI）組，每組5只，Ctr組飼喂普通飼料，HFC組飼喂高脂飼料，CMI組采用高脂飲食、靜脈注射VD3和異丙腎上腺素聯(lián)合建立痰瘀證慢性心肌缺血模型，連續(xù)造模24周，分別通過(guò)測(cè)定動(dòng)物體重、心電圖、活動(dòng)、血脂、心肌酶、血液流變學(xué)、炎癥、心臟指數(shù)(CI）和心肌缺血面積(MIS）來(lái)評(píng)價(jià)模型的建立及痰瘀互結(jié)證的病理進(jìn)程。結(jié)果 與Ctr組，HFC組體重、心率(HR）、總膽固醇(TC）、低密度脂蛋白(LDL-C）、高密度脂蛋白(HDL-C）、動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI）、低、中、高切全血粘度和還原粘度、紅細(xì)胞電泳時(shí)間(EPT）、超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP）和白介素-6(IL-6）水平均明顯升高(P＜0.05，P＜0.01）；CMI組體重、HR、24 h總的ST段升高數(shù)(∑ST）、24 h內(nèi)平均ST段升高數(shù)(ST-average）、活動(dòng)度、TC、甘油三酯(TG）、LDL-C、HDL-C、AI、肌酸激酶(CK）、乳酸脫氫酶(LDH）、肌鈣蛋白-1 (cTn-1）、低、中、高切全血粘度和還原粘度、EPT、卡松粘度(CV）、hs-CRP、IL-6、CI和MIS均顯著升高(P＜0.05，P＜0.01），脂聯(lián)素(APN）水平則顯著降低(P＜0.05）；與HFC組比，CMI組AI、CK、LDH、cTn-1、低、中、高切全血粘度、EPT、CI和MIS均明顯高于HFC組(P＜0.05，P＜0.01），且APN水平則顯著低于HFC組(P＜0.05）。相關(guān)分析顯示，MIS與TC、LDL-C、AI、CK、LDH、cTn-1、APN、高、中、低切全血粘度、EPT、CV、hs-CRP和IL-6有關(guān)(P＜0.05，P＜0.01），同時(shí)線性回歸分析顯示，痰瘀與TC、LDL-C、AI、CK、LDH、cTn-1、APN、EPT、CV、hs-CRP和IL-6有關(guān)(P＜0.01），進(jìn)一步線性逐步回歸分析顯示痰瘀衍變與TC、CK和IL-6密切相關(guān)(P＜0.01）。結(jié)論 高脂喂養(yǎng)和注射VD3和異丙腎上腺素能成功建立痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血小型豬模型，且脂質(zhì)代謝、血液流變學(xué)、心肌酶代謝和炎癥可作為痰瘀互結(jié)證的客觀生化物質(zhì)基礎(chǔ)，這些變化可反映了中醫(yī)理論“痰瘀互結(jié)、瘀毒致變”的相關(guān)生物學(xué)基礎(chǔ)。

痰瘀互結(jié)證；慢性心肌缺血模型；小型豬

冠心病(coronary heart disease，CHD）為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS）性心臟病，其基本病理過(guò)程為心肌供血不足所致心肌損傷，又稱缺血性心臟病。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性心臟病是心脈不通而產(chǎn)生胸痹心痛，且其發(fā)病率的升高與現(xiàn)代生活方式和飲食結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，如飲食不節(jié)，過(guò)食肥甘厚味，嗜酒無(wú)度致脾胃失健，運(yùn)化無(wú)力，聚液為痰，痰濁阻塞脈道，使氣血運(yùn)行不暢而誘發(fā)胸痹心痛。故膏脂不化是冠心病“痰濁”化生的啟動(dòng)子，“痰濁”、“血瘀”為其主要的中醫(yī)病理改變，且痰瘀互結(jié)證是CHD常見(jiàn)的證型之一［1］，因此，探討胸痹心痛痰瘀衍變與脂代謝的關(guān)系成為當(dāng)前研究的焦點(diǎn)，然而痰濁與血瘀間的病理關(guān)系如何，脂質(zhì)異常如何影響痰瘀衍變的發(fā)生發(fā)展，是否還有其它因子參與目前還均不明確。可見(jiàn)，建立理想的動(dòng)物模型是研究中醫(yī)痰瘀互結(jié)證缺血性心臟病的病理機(jī)制和干預(yù)治療的重要手段之一。

小型豬的飲食行為、生理解剖、脂質(zhì)構(gòu)成與代謝機(jī)制均與人類最為接近，并隨年齡增長(zhǎng)可自發(fā)AS，且其冠脈側(cè)枝循環(huán)少，對(duì)缺血性損傷敏感，相比犬、兔、鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有明顯優(yōu)勢(shì)。而以往缺血性模型大多采用冠脈結(jié)扎或藥物注射引起血管急性狹窄或閉塞，但其病程為急性經(jīng)過(guò)，與臨床的病理生理進(jìn)程差異較大。盡管近來(lái)也有采用球囊損傷加高脂誘導(dǎo)或Ameriod縮窄環(huán)等手術(shù)方法建立慢性心肌缺血模型［2，3］，但均需要有高超的人員手術(shù)技能和設(shè)備條件所支撐，不利于推廣，同時(shí)存在術(shù)后感染或破壞胸腔內(nèi)環(huán)境等并發(fā)癥的危險(xiǎn)。因此，本文根據(jù)中醫(yī)理論，采用高脂飲食和靜脈注射維生素D3(VD3）和異丙腎上腺素(Iso）復(fù)制痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血小型豬模型，從多角度評(píng)價(jià)該模型的特征，探討痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血的中醫(yī)生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～5月齡雄性巴馬小型豬15只，體重為10～14 kg，購(gòu)于上海南匯區(qū)老港鎮(zhèn)華新特種養(yǎng)殖場(chǎng)［SCXK(滬）2007-0013］；飼養(yǎng)于本中心普通級(jí)實(shí)驗(yàn)室［SYXK(浙）2008-0116］，室內(nèi)溫度(22± 2）℃，相對(duì)濕度(50±5）％，12 h/12 h明暗交替。

1.2 主要儀器及試劑

7020全自動(dòng)生化分析儀，日本日立公司；酶標(biāo)儀，芬蘭Thermo Fisher公司；大動(dòng)物無(wú)創(chuàng)生理信號(hào)遙測(cè)系統(tǒng)，法國(guó)EMKA公司；FASCO-3020B全自動(dòng)血液流變學(xué)分析儀，重慶大學(xué)維多生物工程研究所。甘油三酯(TG）、總膽固醇(TC）、高密度脂蛋白(HDL-C）、低密度脂蛋白(LDL-C）、乳酸脫氫酶(LDH）、肌酸激酶(CK）試劑盒由上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司提供；肌鈣蛋白-1(cTn-1）、脂聯(lián)素(APN）、超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP）、白介素-6 (IL-6）ELISA試劑盒由上海卓康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 模型建立：適應(yīng)6周后，按體重和血脂水平隨機(jī)分成3組，每組5只，即正常對(duì)照(control，Ctr）組飼喂基礎(chǔ)飼料；高脂(high fat-cholesterol diet，HFC）組，飼喂高脂飼料；痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血(chronic myocardial ischemia，CMI）組在飼喂高脂飲食的同時(shí)，并于造模0、4、8周時(shí)耳緣靜脈注射5萬(wàn)IU/kg VD3，從第12周開(kāi)始每周1次耳緣靜脈注射Iso 25 μg/kg，直至第24周結(jié)束。連續(xù)飼養(yǎng)24周，飼喂量按體重2.5％給予，分成兩等份，1日兩次，每?jī)芍芊Q重更換1次飼料量，高脂飼料配方為10％蛋黃粉、15％起酥油、1.5％膽固醇、73.5％基礎(chǔ)飼料。

1.3.2 觀察指標(biāo)：

1.3.2.1 臨床表征觀察：觀察各組小型豬的外觀毛色、精神、行為活動(dòng)、舌質(zhì)和體重等。

1.3.2.2 生化測(cè)定：造模24周時(shí)取前腔靜脈血2 mL，分離血清，在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、LDH和 CK水平；并用ELISA法測(cè)定血清cTn-1、APN、hs-CRP和IL-6水平，并計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)AI(即AI=LD L-C/HDL-C）。

1.3.2.3 血液流變學(xué)測(cè)定：造模24周取枸櫞酸鈉抗凝血，測(cè)定各組小型豬低(LWBV）、中(MWBV）、高(HWBV）切全血粘度、低(LRV）、中(MRV）、高(HRV）切還原粘度、紅細(xì)胞電泳時(shí)間(EPT）和卡松粘度(CV）。

1.3.2.4 生理監(jiān)測(cè)：造模24周后，按文獻(xiàn)［4］方法用無(wú)創(chuàng)生理信號(hào)遙測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)清醒自由活動(dòng)狀態(tài)下各組小型豬24 h的心電和活動(dòng)情況，并按每小時(shí)劃分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，觀察心率(HR）、24 h總的ST段升高數(shù)(∑ST）、24 h內(nèi)平均ST段升高數(shù)(ST-average）和活動(dòng)度。

1.3.2.5 心肌缺血面積(myocardial ischemia size，MIS）測(cè)定：經(jīng)3％戊巴比妥鈉溶液1 mL/kg麻醉后，再靜脈注射10％KCl溶液1 mL/kg處死，立即取心臟，將心臟均勻分成5份，用0.1％NBT染液在37℃水浴10 min，隨后用蒸餾水沖洗心肌片，數(shù)碼相機(jī)攝像，用Image J軟件分析MIS。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù) ±s表示，并采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差(one-way ANOVA）分析和 L-S-D檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson R和多元線性回歸分析，P＜0.05表示有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 臨床表征

試驗(yàn)期間，Ctr組體重呈緩慢增長(zhǎng)，行走時(shí)不時(shí)地?cái)[尾，拱地行為較多，被毛光澤，鼻盤濕潤(rùn)，精神較好，貪食飽后多睡，舌苔淡紅薄白；HFC組高脂飲食后體重增加顯著(P＜0.01），飽后多睡，拱地行為有所減少，被毛油膩，脫毛明顯，鼻盤濕潤(rùn)，后期活動(dòng)略有增加，舌苔厚膩；CMI組首次注射VD3后食欲降低，2周適應(yīng)后增重明顯并顯著高于Ctr組(P＜0.01），前期表現(xiàn)與HFC組類似，飽后多睡，拱地行為有所減少，被毛油膩雜亂，無(wú)光澤，脫毛明顯，后期活動(dòng)增加，焦慮抵抗行為增多，易激惹，鼻盤濕潤(rùn)略紫，舌苔暗紫且厚膩；當(dāng)注射Iso后出現(xiàn)明顯的缺血癥狀，表現(xiàn)為機(jī)體背部、下腹部出現(xiàn)紅色瘀斑，喘息急促，趴伏煩躁或不動(dòng)，并且耳部皮膚瘀紫等。電生理遙測(cè)顯示，24周后HFC組和CMI組HR均明顯增加(P＜0.05），且CMI組∑ST、ST-aver和活動(dòng)度均顯著高于Ctr組(P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組體重、心電和活動(dòng)的變化(±s，n=5）Tab.1 Changes of body weight，electrocardiogram and activity in each grouP

表1 各組體重、心電和活動(dòng)的變化(±s，n=5）Tab.1 Changes of body weight，electrocardiogram and activity in each grouP

注：與Ctr組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與HFC組比較，#P＜0.05.Note.*P＜0.05，**P＜0.01 vs.Ctr grouP；#P＜0.05 vs.HFC grouP.

活動(dòng)度activity(g）正常對(duì)照Ctr組 25.05±1.60 76.08±0.53 1.28±0.48 0.055±0.020 0.022±0.002高脂HFC組 37.06±1.74** 86.60±4.20* 2.17±0.56 0.099±0.020 0.029±0.005痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血CMI組 36.34±3.92** 86.89±6.05* 4.00±0.88* 0.167±0.037* 0.032±0.001**指標(biāo)Parameters體重(Weight）(kg）心率(HR）(bPm）24 h總的ST段升高數(shù)(∑ST）(mv）24 h內(nèi)平均ST段升高數(shù)(ST-average）(mv）

2.2 血脂代謝的變化

與Ctr組比，造模24周時(shí) HFC和CMI組TC、LDL-C、HDL-C和AI指數(shù)均明顯升高(P＜0.05，P＜0.01），且CMI組TG水平升高顯著(P＜0.05，P＜0.01）；同時(shí)CMI組AI指數(shù)顯著高于HFC組(P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.3 心肌酶的變化

造模24周時(shí)CMI組CK、LDH和cTn-1水平均顯著高于Ctr組和HFC組(P＜0.05，P＜0.01），同時(shí)APN水平則顯著低于Ctr組和HFC組(P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.4 血液流變學(xué)分析

與Ctr組比，HFC和CMI組小型豬低、中、高切全血粘度和還原粘度、紅細(xì)胞電泳時(shí)間均明顯升高(P＜0.05，P＜0.01），且CMI組卡松粘度亦升高顯著(P＜0.01）；同時(shí)，CMI組低、中、高切全血粘度和紅細(xì)胞電泳時(shí)間均顯著高于HFC組(P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.5 炎癥和心肌缺血面積（MIS）的變化

與Ctr組比，HFC和CMI組血清hs-CRP和IL -6水平均明顯升高(P＜0.05，P＜0.01）；另外，CMI組CI和MIS均顯著高于Ctr和HFC組(P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖1 各組血脂代謝的變化Note.*P＜0.05，**P＜0.01 vs.Ctr grouP；#P＜0.05 vs.HF C grouP.(A）total cholesterol，TC；(B）triglyceride，TG；(C）low density liPoProtein，LDL-C；(D）high density liPoProtein，HDL-C；(E）LDL-C：HDL-C ratio.Fig.1 Changes of serum liPid metabolism in each grouP

圖2 各組心肌酶代謝的變化Note.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Ctr grouP；#P＜0.05，##P＜0.01 vs.HFC grouP.(A）Creatine kinase，CK；(B）Lactate dehydrogenase，LDH；(C）TroPonin-1，cTn-1；(D）AdiPonectin，APN.Fig.2 Changes of myocardial enzyme metabolism in each grouP

表2 各組血液流變學(xué)的變化(±s，n=5）Tab.2 Changes of hemorheological Parameters in each grouP

表2 各組血液流變學(xué)的變化(±s，n=5）Tab.2 Changes of hemorheological Parameters in each grouP

注：與Ctr組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與HFC組比較，#P＜0.05.Note.*P＜0.05，**P＜0.01 vs.Ctr grouP；#P＜0.05 vs.HFC grouP.

卡松粘度CV(mPa·s）正常對(duì)照Ctr組 3.55± 0.68組別GrouPs全血粘度(WBV，mPa·s） 還原粘度(RV，mPa·s）高切HWBV (200/S）中切MWBV (30/S）低切LWBV (3/S）高切HRV (200/S）中切MRV (30/S）低切LRV (3/s）紅細(xì)胞電泳時(shí)間EPT(s）2.19± 0.19痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血CMI組1.87± 0.32高脂HFC組 4.49± 0.21* 3.55± 0.68 3.55± 0.68 3.39± 1.23 4.33± 1.50 11.41± 3.11 13.31± 2.55 4.49± 0.21* 4.49± 0.21* 4.68± 0.42* 5.88± 0.50* 14.38± 1.04* 16.84± 0.78* 5.65± 0.41** 5.65± 0.41** 5.65± 0.41*# 5.54± 0.84* 7.06± 1.06* 16.96± 2.31* 21.16± 1.52*# 2.92± 0.24*#

注：與Ctr組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與HFC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01.(A）超敏C-反應(yīng)蛋白，hs-CRP；(B）白介素-6，IL-6；(C）心臟指數(shù)，CI；(D）心肌缺血面積，MIS。

2.6 相關(guān)性及線性回歸分析

相關(guān)分析顯示 MIS與脂質(zhì)代謝(TC、LDL-C、AI）、心肌酶(CK、LDH、cTn-1）、血液粘滯(高、中、低切全血粘度、EPT和CV）、炎癥(hs-CRP和IL-6）呈顯著正相關(guān)(P＜0.05，P＜0.01），與APN呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01），見(jiàn)表3。同時(shí)，根據(jù)中醫(yī)“痰、瘀”病理結(jié)合相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行回歸分析，以“痰、瘀”因素為因變量y(Ctr組=0，HF組=1，CMI組=2），以相關(guān)指標(biāo)為自變量，進(jìn)入線性回歸分析得到進(jìn)入模型的變量為：TC、LDL-C、AI、CK、LDH、cTn-1、APN、 EPT、CV、hs-CRP和IL-6(R=0.995，P=0.009）；進(jìn)一步線性逐步回歸分析后進(jìn)入模型的變量為TC、CK和IL-6；共得到三個(gè)回歸方程，即y=0.018+ 0.168TC，R=0.640，P=0.000；y=-0.431 + 0.136TC+0.001CK，R=0.910，P=0.000；y=-1.108+0.108TC+0.001CK+0.035IL-6，R= 0.939，P=0.000；可見(jiàn)，“痰、瘀”衍變與TC、CK和IL-6密切相關(guān)，是誘發(fā)或加重痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血的關(guān)鍵因子。

表3 MIS與脂質(zhì)代謝、心肌酶代謝、血液粘滯和炎癥指標(biāo)的相關(guān)性Tab.3 RelationshiP between MIS and blood liPid metabolism，myocardial enzyme metabolism，blood viscosity and inflammatory Parameters

3 討論

中醫(yī)證候是疾病發(fā)生和演變過(guò)程中某階段以及個(gè)體當(dāng)時(shí)所處特定內(nèi)外環(huán)境本質(zhì)的反映，也就是說(shuō)，疾病的病因和病理共同構(gòu)成了證候的本質(zhì)。目前認(rèn)為中醫(yī)胸痹心痛的發(fā)生與飲食結(jié)構(gòu)失衡、高脂高蛋白高糖等飲食過(guò)度攝入、人類生活方式改變?nèi)邕\(yùn)動(dòng)量和強(qiáng)度減少，導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，且脂質(zhì)異常已被證實(shí)與心腦血管疾病密切相關(guān)。小型豬是一種理想的且正開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其冠脈側(cè)枝血管較少，心臟解剖結(jié)構(gòu)和血管大小、凝血因子和纖溶系統(tǒng)亦與人類的接近程度遠(yuǎn)優(yōu)于其它動(dòng)物［5］，且心肌缺血后的血管生成能力有限；并可克服試驗(yàn)研究中生長(zhǎng)過(guò)快、不易操作等缺點(diǎn)，故小型豬模型的穩(wěn)定性較好。AS是CHD的病理基礎(chǔ)，其主要特征是動(dòng)脈血管壁鈣化和動(dòng)脈壁的脂質(zhì)沉積。趙娟等［6］采用VD3聯(lián)合高脂飼料能引起大鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C的升高，導(dǎo)致動(dòng)脈病變?cè)缙趦?nèi)皮細(xì)胞的損傷，使血管內(nèi)皮的完整性被破壞，形成AS。同時(shí)，注射異丙腎上腺素誘導(dǎo)動(dòng)物心肌缺血或心肌肥厚是經(jīng)典的心肌重構(gòu)模型，其通過(guò)增加心率和心肌收縮力等途徑，使得心肌耗氧量增加，導(dǎo)致心臟超負(fù)荷和心肌微循環(huán)障礙，冠脈痙攣和心肌梗死或心肌細(xì)胞肥大、壞死，而這些病理?yè)p傷與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等均有密切的聯(lián)系［7］。同樣，本課題組前期已證實(shí)氧化應(yīng)激途徑參與了慢性心肌缺血的形成外［8］，本研究也發(fā)現(xiàn)痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血組心肌酶指標(biāo)CK、LDH和cTn-1均明顯升高，APN顯著降低，表明心肌缺血發(fā)生時(shí)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起多種胞漿酶如CK、LDH的大量釋放，使血清中酶活性增高，而且心肌肌鈣蛋白cTn作為臨床診斷冠心病急性心肌缺血的金標(biāo)準(zhǔn)，缺血時(shí)cTn-1在血中濃度升高迅速。最近，也發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征患者中脂聯(lián)素水平均有明顯的降低［9］。此外，也觀察到痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血小型豬有明顯的心率加快、喘息急促、心電圖異常、舌質(zhì)暗紫、舌苔厚膩和心肌缺血等癥狀，表明本模型已成功模擬了人類中醫(yī)痰瘀互結(jié)證冠心病的病因和病理過(guò)程。

中醫(yī)認(rèn)為“痰濁、血瘀”都是“有形之邪”，既是病理產(chǎn)物也是致病因素。臨床研究表明冠心病痰濁型與脂代謝紊亂密切有關(guān)，且血脂異常是痰凝心脈的物質(zhì)基礎(chǔ)［10］，TC、TG和LDL-C升高是“痰濁”證的重要生化指標(biāo)和物質(zhì)基礎(chǔ)；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)血液流變學(xué)異常是痰瘀痹阻的物質(zhì)基礎(chǔ)，并在痰證和痰瘀證中均表現(xiàn)為血液粘滯性的異常變化［11］。這與本研究結(jié)果一致，單純高脂組和慢性心肌缺血組均出現(xiàn)TC和LDL-C水平的升高，表明高脂飲食能形成明顯的“痰濁”證；同時(shí)全血粘度和還原粘度、紅細(xì)胞電泳時(shí)間亦出現(xiàn)明顯升高，這也證實(shí)了痰證和痰瘀證中均有血液流變學(xué)的明顯異常改變，血液存在高粘滯性、瘀滯明顯，符合中醫(yī)“血瘀”的病理改變。另外，盡管長(zhǎng)期單純高脂飲食可致輕微的缺血癥狀，但無(wú)心肌酶代謝的異常改變來(lái)看，符合“痰可挾瘀”的觀點(diǎn)；此外，從慢性心肌缺血組不僅出現(xiàn)心肌酶代謝CK、LDH、cTn-1的明顯升高和APN的顯著降低，還出現(xiàn)明顯的缺血癥狀來(lái)看，這也支持了“痰可致瘀”的觀點(diǎn)。綜合以上結(jié)果，提示痰瘀互結(jié)證比痰濁、血瘀的病理改變更為嚴(yán)重。因此，本文建立的慢性心肌缺血模型能真實(shí)的反映“痰中挾瘀”和“痰可致瘀”的特點(diǎn)，且痰、瘀兩者相互糾結(jié)，最終形成痰瘀互阻，提示痰瘀具有共同的病理生理基礎(chǔ)，而脂質(zhì)紊亂可能是痰瘀共同致病的病因所在；且痰瘀互結(jié)能加重血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、促使脂質(zhì)沉積，心肌供血減少，形成惡性循環(huán)，加速AS病變的發(fā)生發(fā)展，故痰瘀互結(jié)是CHD發(fā)生的主要病機(jī)，并貫穿其全過(guò)程。

《諸病源候論》中云：“諸痰者，此由血脈壅塞，飲水積聚而不消散，故成痰也”，揭示瘀血化痰的病理進(jìn)程。在本研究也發(fā)現(xiàn)慢性心肌缺血組TG水平明顯高于高脂組，且TG升高也是CHD痰濁的重要生化物質(zhì)基礎(chǔ)，表明“瘀可致痰”；也證實(shí)“痰瘀證”病理程度比痰證更嚴(yán)重。眾所周知，AS是CHD的病理基礎(chǔ)，而全身炎癥也是影響冠脈AS斑塊穩(wěn)定性的重要因素。研究認(rèn)為CHD炎癥學(xué)說(shuō)中提及的各種病因和炎癥介質(zhì)，均可歸于中醫(yī)毒邪學(xué)說(shuō)中的內(nèi)毒或外毒，各種炎性因子對(duì)機(jī)體而言實(shí)為毒邪［12］，且熱毒與胸痹心痛的關(guān)系密切［13］。 何啟揚(yáng)等［14］認(rèn)為CHD熱毒形成需經(jīng)歷三個(gè)階段：即臟腑功能失常，氣血津液紊亂，最終毒損心絡(luò)。Wang等研究表明在急性冠脈綜合征患者中血清CRP和IL-6等炎癥因子明顯升高，與斑塊穩(wěn)定性有關(guān)［15］。黃衍壽等［16］研究表明急性冠脈綜合征患者用三黃片治療后明顯降低炎癥指標(biāo)IL-6和CRP水平，揭示冠心病毒邪致病的機(jī)制。此外，于俊生等［17］提出AS斑塊與痰濁、瘀血、毒邪密切有關(guān)。在本研究中盡管高脂組和慢性心肌缺血組血清hs-CRP和IL-6水平均明顯升高，但痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血組均高于單純高脂組，恰這與動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)AI顯著高于單純高脂組是相一致，這也反映了痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血模型存在痰濁、血瘀、毒邪三者，且密不可分。另外，慢性心肌缺血組MIS程度、心肌酶水平、血液的粘滯性和炎性水平均較長(zhǎng)期單純高脂組嚴(yán)重，這也從側(cè)面反映了“痰濁”是CHD的啟動(dòng)因子，“血瘀”和“毒邪”則是促進(jìn)斑塊易損和突發(fā)心血管事件的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，這與陳可冀院士及其課題組［18］提出的“瘀毒致變”假說(shuō)是相一致的，闡釋“瘀毒”衍變是由量變到質(zhì)變的漸進(jìn)過(guò)程，最終毒損心絡(luò)，導(dǎo)致心血管事件的突發(fā)。最后，本研究相關(guān)分析亦顯示，MIS與TC、LDL-C、AI、CK、LDH、cTn-1、APN、全血粘度、紅細(xì)胞電泳時(shí)間、卡松粘度、hs-CRP、IL-6等指標(biāo)密切相關(guān)，證實(shí)心肌缺血程度與“痰、瘀、毒”三者是密不可分。另外，對(duì)“痰、瘀”病理進(jìn)行回歸分析顯示，“痰、瘀”與 TC、LDL-C、AI、CK、LDH、cTn-1、APN、紅細(xì)胞電泳時(shí)間、卡松粘度、hs-CRP和IL-6等相關(guān)；進(jìn)而線性逐步回歸分析得到TC、CK和IL-6這三個(gè)關(guān)鍵因子，而這也證實(shí)“痰、瘀、毒”的衍變是一個(gè)漸進(jìn)、量變到質(zhì)變的進(jìn)程。

綜上所述，本研究以中醫(yī)理論為指導(dǎo)并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)，成功建立了痰瘀互結(jié)證心肌缺血小型豬模型，且其病程相對(duì)緩慢，符合中醫(yī)“痰濁、血瘀、毒邪”的衍變規(guī)律；且脂質(zhì)代謝、血液流變學(xué)、心肌酶代謝和炎癥指標(biāo)可作為評(píng)價(jià)該模型的生物學(xué)基礎(chǔ)，這為人類中醫(yī)證候冠心病的研究和藥物干預(yù)機(jī)制提供可靠的參考依據(jù)。

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Establishment of a minipig model of chronic myocardial ischemia of phlegm-blood stasis syndrome type

PAN Yong-ming，CHEN Liang，XU Xiao-Ping，ZHU Ke-yan，XU Jian-qin，CHEN Min-li
(Laboratory Animal Research Center/ComParative Medical Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

Objective To establish a disease syndrome combined animal model，the miniature Pig model ofchronic myocardial ischemia of Phlegm-blood stasis syndrome tyPe，by high fat/cholesterol diet feeding and intravenous injection with VD3and isoProterenol.Methods Miniature Pigs were randomly divided into the control(Ctr）grouP，high fat/cholesterol diet(HFC）grouP and chronic myocardial ischemia model of Phlegm-blood stasis syndrome(CMI）grouP，5 Pigs in each grouP.The Ctr grouP was fed with normal regular chow diet，HFC grouP was fed with high fat/cholesterol diet，while the CMI grouP was fed with high fat/cholesterol diet and intravenous injection with VD3and isoProterenol.The exPeriment lasted for 24 weeks.The model establishment and its Pathological Process of Phlegm-blood stasis syndrome were evaluated by examinations of body weight，electrocardiogram，activity，blood liPid，myocardial enzymes，hemorheology，inflammation，cardiac index(CI）and myocardial ischemia size(MIS）.Results ComPared with the Ctr grouP，the body weight，heart rate(HR），Total cholesterol(TC），low density liPoProtein-cholesterol(LDL-C），high density liPoProteincholesterol(HDL-C），atherosclerosis index(AI），low/middle/high shear rate of whole blood viscosity and reduced viscosity，erythrocyte electroPhoresis time(EPT），high-sensitivity C-reactive Protein(hs-CRP）and IL-6 levels in the HFC grouP were significantly increased(P＜0.05，P＜0.01），while the body weight，heart rate，total ST，ST-average，activity，TC，TG，LDL-C，HDL-C，AI，CK，LDH，cTn-1，low/middle/high shear rate of whole blood viscosity and reduced viscosity，EPT，Casson viscosity(CV），hs-CRP，IL-6，CI and MIS in the CMI grouP were significantly increased (P＜0.05，P＜0.01），and APN level in the CMI grouP was significantly decreased(P＜0.05）.Moreover，AI，CK，LDH，cTn-1，low/middle/high shear rate of whole blood viscosity，EPT，CI and MIS in the CMI grouP were significantly higher than those of HFC grouP(P＜0.05，P＜0.01），while APN in the CMI grouP was significantly lower than that of HFC grouP(P＜0.05）.Correlation analysis showed that MIS was closely correlated to TC，LDL-C，AI，CK，LDH，cTn-1，APN，high/middle/low shear rate of whole blood viscosity，EPT，CV，hs-CRP and IL-6(P＜0.05，P＜0.01）.The linear regression analysis also showed that Phlegm-blood stasis was closely correlated to TC，LDL-C，AI，CK，LDH，cTn-1，APN，CV，EPT，hs-CRP，and IL-6(P＜0.01），and further linear stePwise regression analysis showed that the evolution of Phlegm-blood stasis was closely related to TC，CK and IL-6.Conclusions MiniPig model of chronic myocardial ischemia of Phlegm-blood stasis syndrome tyPe can be established by high fat/cholesterol diet feeding and intravenous injection with VD3and isoProterenol.Their blood liPid metabolism，hemorheology，myocardial enzymes and inflammatory indexes can be used as external biochemical basis of Phlegm-blood stasis syndrome tyPe，which may reflect related biological basis of the traditional Chinese medicine theory of“Phlegm and stasis cementation，blood-stasis＆amp；toxin causing catastroPhe”.

Phlegm-blood stasis syndrome，Chronic myocardial ischemia model，MiniPig

R-33 < class="emphasis_bold">【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

A

1671-7856（2015）09-0001-07

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.009.001

1.省部共建科研基金(WKJ2009-2-032）；2.“浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目”資助；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(XTD201301）。

潘永明(1979-），男，助理研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail：Pym918@126.com。

陳民利(1963-），女，教授，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail：cmli991@aliyun.com。

2015-07-24