不同條件環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫力低下模型的比較及偏最小二乘法(PLS）數(shù)學建模分析

高 敏，侯衍豹，楊 勇，2，孫啟慧，王桂美，張成博

(1.山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355；2.山東省經(jīng)方研究重點實驗室，濟南 250355）

不同條件環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫力低下模型的比較及偏最小二乘法(PLS）數(shù)學建模分析

高 敏1，侯衍豹1，楊 勇1，2，孫啟慧1，王桂美1，張成博1

(1.山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355；2.山東省經(jīng)方研究重點實驗室，濟南 250355）

目的通過比較4種不同劑量、周期的環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫力低下模型，并采用偏最小二乘法(PLS）建模分析篩選出最優(yōu)方案。方法 雄性昆明小鼠58只隨機分成5組，分別為正常組10只，每日注射生理鹽水；模型1組12只，按照40 mg/kg的劑量連續(xù)注射環(huán)磷酰胺溶液10 d；模型2組12只，按照80 mg/kg的劑量連續(xù)注射環(huán)磷酰胺溶液3 d；模型3組12只按照40 mg/kg的劑量注射2次環(huán)磷酰胺溶液，每次間隔(2～3）d；模型4組12只按照50 mg/kg的劑量連續(xù)注射環(huán)磷酰胺溶液7 d。監(jiān)測不同劑量和不同周期給予小鼠環(huán)磷酰胺后，模型小鼠的飲食、飲水、體重等日常代謝指標的變化；測定小鼠胸腺、脾等臟器指數(shù)以及血常規(guī)等免疫指標的變化；采用SIMCA-P軟件處理小鼠的終體重、終肛溫、臟器指數(shù)、血常規(guī)等指標，應用偏最小二乘法(PLS）綜合評價免疫力低下小鼠模型的建立。結果 與正常組相比，模型組小鼠體重和肛溫降低且差別有顯著性意義(P＜0.05）；日平均飲食、飲水量降低且差異有顯著性(P＜0.01）；脾指數(shù)和胸腺指數(shù)降低且差別有極顯著性意義(P＜0.01）；模型組嗜堿細胞絕對值和嗜堿細胞百分比均降低且差異有顯著性(P＜0.05），模型組平均RBC血紅蛋白濃度、大血小板比率均升高且有顯著性差異，模型1組、模型2組、模型4組的白細胞、淋巴細胞絕對值均降低且差異有顯著性(P＜0.05）。PLS分析處理表明，模型1組、模型2組、模型4組與正常組比較差異都具有顯著性(P＜0.01），其中模型1組差異最大。結論 通過PLS分析方法綜合不同指標，模型1組按照40 mg/kg的劑量連續(xù)注射10 d為最佳造模方法，為建立穩(wěn)定的免疫力低下模型提供實驗依據(jù)。

環(huán)磷酰胺；免疫抑制；血常規(guī)；數(shù)學建模；免疫力低下模型

免疫力是人體識別和排除異己的生理反應，維護體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，抵抗外來侵襲的能力。免疫力低下是免疫系統(tǒng)不能正常發(fā)揮保護作用，導致人體極易招致細菌、病毒、真菌等感染而患病。免疫系統(tǒng)是抵御病原菌侵犯最重要的保衛(wèi)系統(tǒng)，由免疫器官(骨髓、脾臟、胸腺、淋巴結）、免疫細胞(淋巴細胞、單核吞噬細胞、中性粒細胞、嗜堿粒細胞、嗜酸粒細胞、肥大細胞）、血小板以及免疫分子組成。環(huán)磷酰胺是臨床上常用的一種廣譜抗腫瘤藥，可干擾DNA及RNA功能，它與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結，抑制DNA合成，導致細胞死亡。環(huán)磷酰胺具有較強的免疫抑制功能，是建立免疫抑制動物模型的常用陽性藥物［1］。

偏 最 小 二 乘 回 歸 (Partial least-squares regression，PLS）是一種新型的多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析方法，主要用來解決多元回歸分析中的變量多重相關性或解釋變量多于樣本點等實際問題，理論研究進展非常迅速，其應用不斷擴展，涉及化工、機械、生物、醫(yī)學、藥物學等領域［2］。本研究是通過監(jiān)測環(huán)磷酰胺4種不同用藥劑量和用藥周期對模型小鼠體重、肛溫、小鼠臟器指數(shù)、血常規(guī)等指標影響變化，采用SIMCA-P軟件的偏最小二乘法回歸(PLS）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計建模分析，通過PLS分析方法對免疫抑制模型進行綜合評價，來確定建立小鼠免疫抑制的最佳條件，為建立穩(wěn)定的免疫力低下的動物模型提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物：昆明小鼠，雄性，(20±2）g，SPF級，由山東魯抗動物實驗中心提供，動物許可證號SCXK(魯）20080002，室溫(22±4）℃，相對濕度65％～70％。使用許可證號：SYXK(魯）20130002。

1.1.2 試劑與藥物 注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號H32020857）；氯化鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號1309222143）。

1.1.3 儀器智能恒溫控制儀(成都泰盟科技有限公司），01193-YP601N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司），XS1000i血液分析儀(日本Sysmex公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組：小鼠適應性飼養(yǎng)3 d后按體重隨機分成正常組(10只）、4個模型組(各12只）。

1.2.2 造模方法：環(huán)磷酰胺干粉用生理鹽水稀釋配成8 mg/mL濃度的環(huán)磷酰胺溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。采用腹腔注射，正常組每日注射生理鹽水；模型1組按照40 mg/kg的劑量連續(xù)注射環(huán)磷酰胺溶液10 d；模型2組，按照80 mg/kg的劑量連續(xù)注射環(huán)磷酰胺溶液3 d；模型3組按照40 mg/kg的劑量注射2次環(huán)磷酰胺溶液，每次間隔(2～3）d；模型4組按照50 mg/kg的劑量連續(xù)注射環(huán)磷酰胺溶液7 d。

1.2.3 測量指標：造模過程中每天測量并記錄各組小鼠體溫、體重、飲食重量、飲水重量。動物處死前先稱體重，解剖后稱量臟器重量(包括：胸腺、脾臟、肺、心臟、肝、腎、腎上腺、睪丸、精囊腺）。計算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)(％）=臟器重量/體重 ×100％）。動物處死前摘眼球取血，EDTA-K2抗凝管抗凝，做血常規(guī)分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

1.3.1 單因素方差分析：實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA）LSD檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

1.3.2 偏最小二乘法分析：采用SIMCA-P軟件的偏最小二乘法(PLS）對各組數(shù)據(jù)進行分析，詳細數(shù)據(jù)結果見實驗結果部分。

2 結果

2.1 小鼠體重及肛溫變化

2.1.1 小鼠體重和肛溫的比較：由表1可見，與正常組相比，模型組小鼠的終體重都降低且均差異具有極顯著性(P＜0.01），模型1組小鼠的終肛溫與正常組相比顯著降低且差異有極顯著性(P＜0.01），其他組差異有顯著性(P＜0.05）。

2.1.2 小鼠體重的變化：由圖1可見，正常組小鼠的體重持續(xù)增長；模型1組、模型2組、模型4組小鼠的體重先增長緩慢后逐漸降低，且終體重較第1天體重有不同程度的降低，自造模第4天起模型1組和模型4組與正常組比較差異出現(xiàn)顯著性(P＜0.05），第 5天開始差異出現(xiàn)非常顯著性(P＜0.01）；自造模第3天起模型2組較正常組差異有顯著性(P＜0.05），第4天出現(xiàn)差異非常顯著性(P＜0.01）；模型3組小鼠的體重增長緩慢，自第5天起模型3組與正常組相比差異出現(xiàn)非常顯著性(P＜0.01）。

2.2 小鼠飲食和飲水的變化

由圖2中可以看出模型組的飲食較正常組減少，整體上模型組飲食較正常組有差異非常明顯的顯著性P＜0.01；由圖3中可以看出模型組的飲水較正常組減少，整體上模型組較正常組有差異非常明顯的顯著性P＜0.01；

2.3 環(huán)磷酰胺對模型組免疫器官指數(shù)的影響

從圖4和圖5看出，環(huán)磷酰胺引起小鼠胸腺和脾臟的萎縮，使得模型組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)較正常組減小且均差異具有顯著性(P＜0.01）。其中模型1組、模型4組與正常組的差異尤其明顯。

2.4 環(huán)磷酰胺對小鼠血液學指標的影響

由表2可見，與正常組相比，模型1組和模型4組小鼠的白細胞計數(shù)、淋巴細胞絕對值、嗜堿細胞絕對值、嗜堿細胞百分比、血小板比積均有不同程度的降低且差異具有顯著性(P＜0.05），單核細胞百分比、中性粒細胞百分比、平均RBC血紅蛋白濃度、大血小板比率有不同程度的升高差異且有顯著性(P＜0.05）；模型2組小鼠白細胞計數(shù)、淋巴細胞絕對值、嗜堿細胞絕對值、嗜堿細胞百分比均有不同程度的降低且差異具有顯著性(P＜0.05），平均RBC血紅蛋白濃度、紅細胞、大血小板比率有不同程度的升高且差異有顯著性(P＜0.05）；模型3組小鼠嗜堿細胞絕對值、嗜堿細胞百分比有不同程度升高且差異有顯著性(P＜0.05），單核細胞百分比、血小板比積、平均RBC血紅蛋白濃度、紅細胞、大血小板比率有不同程度的升高且差異有顯著性(P＜0.05）。

表1 小鼠終體重和終肛溫的比較(±s）Tab.1 ComParison of final body weight and final anal temPerature in the mice(±s）

表1 小鼠終體重和終肛溫的比較(±s）Tab.1 ComParison of final body weight and final anal temPerature in the mice(±s）

注：與正常組相比*P＜0.05，**P＜0.01Note.ComPared with the normal grouP，*P＜0.05，**P＜0.01.

體重(g）Body weight(g） 肛溫(℃）TemPerature(℃）正常組Normal grouP 10 30.88±4.44 36.65±0.83模型1組Model grouP 1 12 19.57±4.63** 34.83±1.02**模型2組Model grouP 2 12 19.97±2.70** 35.80±0.911*模型3組Model grouP 3 12 23.30±4.0** 35.77±0.58*模型4組Model grouP 4 12 20.63±3.91** 35.51±1.63*組別GrouPs動物數(shù)n

圖1 環(huán)磷酰胺對模型小鼠體重的影響Note.ComPared with normal grouP，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.1 Effect of CTX on the daily body weight in mice

圖2 環(huán)磷酰胺對模型小鼠飲食的影響Note：ComPared with the normal grouP，*P＜0.05，**P＜0.01.Fig.2 Effect of CTX on the food intake in mice

圖3 環(huán)磷酰胺對模型小鼠飲水的影響Note.ComPared with the normal grouP，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.3 Effect of CTX on the water intake in mice

表2 環(huán)磷酰胺對模型小鼠血液學指標的影響(±s）Tab.2 Effect of CTX on the haematological Parameters in mice(±s）

表2 環(huán)磷酰胺對模型小鼠血液學指標的影響(±s）Tab.2 Effect of CTX on the haematological Parameters in mice(±s）

組別GrouPs動物數(shù)n白細胞WBC (109/L）淋巴細胞絕對值LYM(109/L）嗜堿細胞絕對值BAS(109/L）單核細胞百分比MON(％）嗜堿細胞百分比BAS％(％）正常組Normal grouP 10 5.003±2.393 2.337±1.689 0.735±0.601 4.250±3.766 16.490±12.551模型1組Model grouP 1 12 0.764±0.507** 0.262±0.218** 0.035±0.066** 25.316±16.251** 3.483±4.852**模型2組Model grouP 2 12 0.961±0.603** 0.852±0.588* 0.026±0.043** 3.583±4.99 2.916±3.703**模型3組Model grouP 3 12 5.008±2.463 1.905±1.873 0.013±0.021** 12.441±9.685* 0.350±0.725**模型4組Model grouP 4 12 0.795±0.389** 0.373±0.180** 0.027±0.033** 21.033±9.741** 3.80±4.481*組別GrouPs N n動物數(shù)n中性粒細胞百分比NEUT％(％）平均RBC血紅蛋白濃度MCHC(g/L）血小板比積PCT(％）紅細胞RBC (1012/L）大血小板比率P-LCR(％）正常組Normal grouP 10 9.320±14.086 295.300±8.353 0.606±0.137 5.730±0.789 5.320±3.118模型1組Model grouP 1 12 35.625±16.309** 304.250±8.245* 0.255±0.168** 4.909±0.81 6.166±4.257*模型2組Model grouP 2 12 5.683±5.144 299.833±7.493 0.557±0.224 9.005±1.380** 9.600±2.705*模型3組Model grouP 3 12 19.366±20.312 308.583±9.337** 1.434±0.371** 8.025±0.831** 10.000±4.635**模型4組Model grouP 4 12 26.400±9.442** 312.166±12.840** 0.396±0.171* 6.002±1.103 8.800±3.0671*

2.5 采用偏最小二乘法（PLS）對各組藥效綜合分析

2.5.1 對本實驗5個組的檢測指標進行標準化處理，自變量表見表3。

2.5.2 得分圖及 VIP(variable imPortance in the Projection）變量投影重要性指標(圖6）。VIP變量投影重要性指標用來描述自變量對因變量的解釋能力，VIP值越大，自變量x對 y的解釋能力越強(圖7）。

圖4 環(huán)磷酰胺對模型小鼠胸腺指數(shù)的影響Note.ComPared with the normal grouP，*P＜0.05，**P＜0.01.Fig.4 Effect of CTX on the thymus index in mice

2.5.3 各組小鼠綜合藥效得分表及比較見表4，圖8。

采用 SIMCA-P軟件的偏最小二乘法回歸(PLS）對模型小鼠的終體重、終肛溫、臟器指數(shù)、血常規(guī)等指標進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計建模分析，模型1組、模型2組、模型4組較正常組差異都有非常顯著性(P＜0.01），其中模型1組尤其明顯是較佳的造模方法。

圖5 環(huán)磷酰胺對模型小鼠脾指數(shù)的影響Note.ComPared with the normal grouP，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.5 Effect of CTX on the sPleen index in mice

表3 自變量表Tab.3 Table of indePendent variables

圖6 各組小鼠綜合得分圖Note.Class1 is the normal grouP，class 2 is the model grouP 1，class 3 is the model grouP 2，class 4 is the model grouP 3，class 5 is the model grouP 4.Fig.6 General factor scores in the mice

圖7 正常組和模型組VIP得分圖Fig.7 Scores of VIP in the mice

表4 各組小鼠綜合藥效得分表Tab.4 General factor scores in mice

圖8 各組小鼠綜合藥效得分比較圖(±s）Note：ComPared with normal grouP，p*＜0.05，p**＜0.01Fig.8 ComParison of general factor scores between different grouPs(±s）

3 討論

在免疫毒理學中，常用的免疫抑制藥物有環(huán)磷酰胺、氫化可的松、地塞米松等［3，4］，已有研究表明，環(huán)磷酰胺能夠造成小鼠體重、免疫器官重量、白細胞計數(shù)及其淋巴細胞百分比等指標的下降，造成較為突出的免疫抑制作用［5，6］，環(huán)磷酰胺其作為陽性藥物是適宜的。

本實驗結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠表現(xiàn)出精神萎靡、體毛稀疏脫落、活動減少、體重和肛溫降低等狀態(tài)，這和環(huán)磷酰胺建立免疫力低下小鼠的相關文獻描述一致［7］；環(huán)磷酰胺能損害小鼠的免疫器官，導致胸腺指數(shù)、脾指數(shù)降低；生殖系統(tǒng)對化學毒物的作用十分敏感，環(huán)磷酰胺長期使用會損傷生殖器官［8］，使精子減少，精囊腺變小，導致小鼠精囊腺指數(shù)降低。環(huán)磷酰胺使白細胞、淋巴細胞等免疫細胞受到損害數(shù)目降低；環(huán)磷酰胺可能會引起模型小鼠的應激反應，導致紅細胞數(shù)目增多；大血小板比率升高說明環(huán)磷酰胺具有明顯的骨髓抑制作用，導致血小板的成熟程度降低，血小板數(shù)量減少，從而使得大血小板比率升高。

本實驗的研究顯示，選用環(huán)磷酰胺四種不同的劑量和周期，對于小鼠的免疫抑制的效果是不同的，通過采用偏最小二乘法(PLS）對模型小鼠的體重、肛溫、臟器指數(shù)、血常規(guī)等指標進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計建模，篩選出按照40 mg/kg的劑量連續(xù)腹腔注射10d為最佳造模方法。本實驗為建立免疫力低下模型提供一定的依據(jù)，為以后免疫力低下的研究提供建立動物模型的參考。

［1］Pel áez B， CamPillo JA， LóPez-Asenjo JA， et al.CycloPhosPhamide induces the develoPment of early myeloid cells suPPressing tumor cell growth by a nitric oxide-dePendent mechanism［J］.J Immunol，2001；166(11）：6608-6615.

［2］王惠文，吳載斌.偏最小二乘回歸的線性與非線性方法［M］.北京：國防工業(yè)出版社.2006：9.

［3］李振魯，白慧玲，趙粵萍，等.白癜丸對小鼠免疫功能的影響［J］.醫(yī)藥導報，2002，21(10）：619-620.

［4］陳艷芬，臧建偉，唐春萍.六味地黃湯生物制劑對氫化可的松模型的藥理作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(5）：1035-1036.

［5］宋雁，賈旭東，崔文明，等.不同途徑和劑量環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型的對比研究［J］.中國食品衛(wèi)生雜志.2013，25(3）：218-225.

［6］齊麗娟，宋雁，王偉，等.用環(huán)磷酰胺建立免疫抑制動物模型［J］.衛(wèi)生研究，2010，39(3）：313-315.

［7］周立峰，邱玉華，程剛，等.圣愈湯對環(huán)磷酰胺誘導的免疫力低下小鼠T細胞亞群和細胞因子的影響［J］.現(xiàn)代實用醫(yī)學，2009，21(8）：808-813.

［8］賈慶軍，劉天鵬，郭魁亮，等.環(huán)磷酰胺對小鼠遺傳和生殖毒性影響的研究(2）—對雄性小鼠生殖細胞的影響 ［J］.白求恩軍醫(yī)學院學報，2006，4(2）：70-71.

Cyclophosphamide-induced immunosuppressive mouse models established under different conditions and mathematical modeling analysis with partial least squares

GAO Min1，HOU Yan-bao1，YANG Yong1.2，SUN Qi-hui1，WANG Gui-mei1，ZHANG Cheng-bo1
(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355；2.Key Laboratory of Shandong Classical PrescriPtion Research，Jinan 250355）

Objective ComParingfourgrouPsofimmunosuPPressivemousemodelsestablished by cycloPhosPhamide administration in different doses and Periods，we used Partial least squares(PLS）analysis to evaluatethe immunosuPPressive mouse models comPrehensively and select the aPProPriate way to establish this model.Methods In this exPerimental study，58 male KM mice were randomly divided into five grouPs：normal grouP(10 mice）were given normal saline daily by i.P.injection，model grouP 1(12 mice）was given 40 mg/kg CTX daily by i.P.injection for 10 days，model grouP 2(12 mice）was given 80 mg/kg CTX daily by i.P.injection for 3 days，model grouP 3(12 mice）was given 40 mg/kg CTX daily by i.P.injection twice for a week，model grouP 4(12 mice）was given 50 mg/kg CTX daily by i.P.injection for 7 days.After the injection of cycloPhosPhamide，the daily metabolic activities were detected everyday such as body weight，water intake，and food intake，organ index and immunological indexes such as blood RT of the model mice were measured as well.Using Partial least squares(PLS）analysis to the models and analyzing the final weight，final anal temPerature，organ index，and blood routine examination in order to evaluate the immunosuPPressive mouse models comPrehensively.Results ComPared with the normal grouP，different dosages of CTX reduced the weight and anal temPerature of model mice(P＜0.05），the food intake and water intake(P＜0.01），and the sPleen index and thymus index(P＜0.01）.Besides，the amount and Percentage of basoPhilic granulocytes decreased(P＜0.05），and the Percentage of MCHC，macroPhage went uP，as well as the absolute value of WBC and lymPhocytes were decreased in the model grouPs 1，2，and 4(P＜0.05）.According to the PLS analysis，there were significant differences among models 1，2，and 4 when comPared with the normal grouP，esPecially the most different in the model grouP 1.Conclusions After the PLS analysis of different indexes，the oPtimal way to establish immunosuPPressive mouse models is the Procedure with 40 mg/kg CTX daily injected i.P.for ten days.Our findings Provide exPerimental evidence for the establishment of immunosuPPressive mouse models.

CycloPhosPhamide；ImmunosuPPression；Blood，routine examination；Mathematical modeling；ImmunosuPPressive mouse models

R-33 < class="emphasis_bold">【文獻標識碼】A

A

1671-7856（2015）09-0062-08

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.009.012

國家自然科學基金項目(81273626）；國家科技重大專項(2014ZX09509001-001）；山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目(XTCX2014B-02）；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃(2013-026）。

高敏(1989-），女，碩士研究生，從事中藥及復方藥理和毒理研究。E-mail：1057850512@qq.com。

楊勇，博士，副教授，從事經(jīng)方的現(xiàn)代研究。E-mail：yy7204@163.com。

2015-07-08