外源性干擾物對(duì)血吸蟲(chóng)間接血凝試驗(yàn)結(jié)果的影響

蘭煒明 ，謝峰 ，黎曉琴 ，姜唯聲 ，謝曙英 ，葛軍 ，曾小軍

(1、江西省寄生蟲(chóng)病防治研究所，江西 南昌330046；2、進(jìn)賢縣血吸蟲(chóng)病防治站，江西 進(jìn)賢331700)

間接血凝試驗(yàn) (IHA，indirect hemagglutination assay)是血吸蟲(chóng)病查病的主要方法[1,2]，現(xiàn)場(chǎng)工作中采集的血清樣本在處理過(guò)程中往往發(fā)生溶血，血吸蟲(chóng)病病人由于個(gè)體差異或合并有其他并發(fā)癥，高膽紅素和高血酯(TG)血清的出現(xiàn)較常見(jiàn)。家兔血吸蟲(chóng)病血清IHA試驗(yàn)中溶血、反復(fù)凍融、肝素抗凝等因素的影響已有報(bào)道[3]，也有報(bào)道顯示在酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)中，結(jié)合膽紅素、溶血血紅蛋白和乳糜在大于一定濃度下可能會(huì)影響ELISA結(jié)果，因此必須注意標(biāo)本的前處理和標(biāo)本的新鮮[4,5]。為了解人血清樣本出現(xiàn)溶血、血脂、膽紅素及抗凝劑是否對(duì)血吸蟲(chóng)病IHA結(jié)果產(chǎn)生影響，本文探討這些物質(zhì)在血吸蟲(chóng)IHA檢測(cè)中的干擾作用，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料 血吸蟲(chóng)病人(糞檢陽(yáng)性人群)血清10份，正常人(來(lái)自非疫區(qū)，未接觸疫水人群)血清10份，膽紅素(分析純，MW584.67上海邁坤化工有限公司批號(hào)：20130410)，脂肪乳注射液(30%脂肪乳注射液西安力邦制藥有限公司 批號(hào)：1209044，甘油三酯的含量為28.55mmol/L)，IHA反應(yīng)板(V型)，血吸蟲(chóng)抗體檢測(cè)試劑盒 (IHA法)(江西環(huán)鄱科技發(fā)展有限公司 批號(hào)：20130509)，生理鹽水，蒸餾水。

1.1.1 溶血樣本制備 真空采血管采集8ml血吸蟲(chóng)病人血清10份，小心吸取血清后，將剩下的血清與紅細(xì)胞置冰箱反復(fù)凍融2次，用希森美康XS-500i血細(xì)胞分析儀檢測(cè)每份溶血樣本血紅蛋白含量。再用每位患者血清稀釋溶血樣本，使每份血清樣本血紅蛋白含量分別為 4g/L、8g/L、16g/L、32g/L。

1.1.2 血漿樣本 對(duì)10名血吸蟲(chóng)病人分別以臨床檢驗(yàn)常規(guī)用檸檬酸鈉抗凝管(含3.8%檸檬酸鈉)、肝素鈉抗凝管(含肝素鈉45IU)和EDTA-K2抗凝管采集患者靜脈血5ml后分離血漿備用。

1.1.3 膽紅素血清樣本制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01g膽紅素 (注意避光)，加入到10ml蒸餾水中，配制成1710μmol/L膽紅素液。用蒸餾水稀釋膽紅素液配置濃度成1000μmol/L膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液[6]。將10份血吸蟲(chóng)病人及正常人血清分別混勻后加入適量膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液，使膽紅素濃度為分別為10、50、100、150、200、250、300、350、400 和 450μmol/L， 在血吸蟲(chóng)病人和正常人血清中加入與膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液等量的生理鹽水作為膽紅素對(duì)照。

1.1.4 甘油三酯血清樣本制備 用蒸餾水稀釋醫(yī)用脂肪乳成含甘油三酯為20和28 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，分別在10份正常人血清和血吸蟲(chóng)病人血清中加入適量甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)液，使血清甘油三酯濃度分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0 和 16.0mmol/L， 在血吸蟲(chóng)病人和正常人血清中加入與膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液等量的生理鹽水作為甘油三酯對(duì)照。

1.2 方法 用血吸蟲(chóng)抗體檢測(cè)試劑盒(IHA法)檢測(cè)采集的血清和血漿，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每份樣本測(cè)試終點(diǎn)滴度。

2 結(jié)果

2.1 溶血血清IHA結(jié)果 10份檢測(cè)樣本中，血紅蛋白濃度為4g/L、8g/L時(shí)，檢測(cè)結(jié)果不變。血紅蛋白濃度為16g/L時(shí)，有3份樣本抗體下降1個(gè)滴度，抗體幾何平均滴度(GMT)為1：40；血紅蛋白濃度為32g/L時(shí)，所有樣品抗體滴度較對(duì)照血清均下降，抗體平均幾何滴度為1：23。見(jiàn)表1。

2.2 含抗凝素血漿及對(duì)照血清的IHA結(jié)果 10份陽(yáng)性血清和血漿進(jìn)行IHA試驗(yàn)，1份以EDTA-K2和1份以肝素鈉抗凝血漿抗體滴度與對(duì)照血清一致，其余血漿樣本效價(jià)較對(duì)照血清均下降1個(gè)滴度，對(duì)照血清GMT為1:49，枸緣酸三鈉、EDTA-K2、肝素鈉血漿GMT分別為1:25、1:26、1:26。見(jiàn)表2。

表1 溶血血清及對(duì)照血清IHA結(jié)果

表2 血清與血漿樣品IHA結(jié)果

2.3 含膽紅素血清及對(duì)照血清IHA結(jié)果 配制的含膽紅素陽(yáng)性和陰性血清及對(duì)照血清進(jìn)行IHA終點(diǎn)滴度試驗(yàn)，顯示膽紅素濃度的高低變化均不會(huì)引起陽(yáng)性血清IHA滴度的改變，也不會(huì)引起陰性血清的誤判。見(jiàn)表3。

表3 含高膽紅素血清及對(duì)照血清IHA結(jié)果

2.4 含甘油三酯血清及對(duì)照血清的IHA結(jié)果 配制的含甘油三酯陽(yáng)性和陰性血清及對(duì)照血清進(jìn)行IHA終點(diǎn)滴度試驗(yàn)，顯示甘油三酯濃度在2.0~5.0 mmol/L時(shí)不會(huì)引起結(jié)果的變化，在6.0~10.0 mmol/L間影響陰性血清結(jié)果的判讀，在11.0 mmol/L以上陽(yáng)性血清出現(xiàn)一個(gè)滴度的上升，同時(shí)影響陰性血清出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。見(jiàn)表4。

3 討論

血吸蟲(chóng)病IHA試驗(yàn)由于敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，是目前疫區(qū)現(xiàn)場(chǎng)用于血吸蟲(chóng)病篩查的主要手段[7,8]，對(duì)血吸蟲(chóng)病可疑病人采血進(jìn)行IHA檢測(cè)血吸蟲(chóng)抗體時(shí)，檢測(cè)樣本中常易出現(xiàn)如溶血、高膽紅素和(或)高血脂及抗凝血漿等情況。在臨床血吸蟲(chóng)病診斷中對(duì)溶血無(wú)嚴(yán)格劃分標(biāo)準(zhǔn)[9,10]，而總膽紅素 1.71～17.1μmol/L(0.1mg/dl～1.0mg/dl)為正常范圍；血漿甘油三酯(TG)1.7～2.3mmol/L為臨界[11]，為獲得與臨床收集樣本基本相似的血清，本研究通過(guò)制備帶有單一干擾物質(zhì)獲得模擬陽(yáng)性和陰性血清進(jìn)行IHA試驗(yàn)，來(lái)驗(yàn)證人工模擬狀態(tài)下外源性干擾物質(zhì)是否對(duì)IHA結(jié)果產(chǎn)生影響及影響的程度，臨床血清樣本中外源性干擾物質(zhì)的實(shí)際影響情況尚需進(jìn)一步探討。

表4 含甘油三酯血清及對(duì)照血清的IHA結(jié)果

結(jié)果顯示，當(dāng)溶血血清樣本血紅蛋白＜16g/L時(shí)對(duì)IHA的檢測(cè)無(wú)影響，血紅蛋白≥16g/L時(shí)，抗體效價(jià)隨血紅蛋白濃度升高而下降，與兔血清溶血樣本檢測(cè)結(jié)果相符[3]。不同抗凝劑血漿樣本中，除2份抗體效價(jià)不一致外，其他樣本結(jié)果均相同，但血清與血漿樣本IHA結(jié)果存在差異，陽(yáng)性血漿樣本進(jìn)行IHA檢測(cè)時(shí)，抗體雖均呈陽(yáng)性，但相較于對(duì)照血清均下降1個(gè)滴度，且GMT較對(duì)照血清有所下降。結(jié)果表明對(duì)于血清抗體水平接近臨界值的樣本，以血漿為檢測(cè)樣本結(jié)果可能為假陰性，因此，在IHA檢測(cè)中不宜以血漿為檢測(cè)樣本。

血清中膽紅素的含量多少對(duì)IHA檢測(cè)結(jié)果亦無(wú)影響。血清甘油三酯濃度在2.0~5.0 mmol/L時(shí)對(duì)試驗(yàn)亦無(wú)影響，但在6.0~10.0 mmol/L間影響陰性血清結(jié)果的判讀，在11.0 mmol/L以上陽(yáng)性血清出現(xiàn)一個(gè)滴度的上升，陰性血清則出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，這與ELISA檢測(cè)結(jié)果報(bào)道相似[3]。血清甘油三酯濃度高于5.0 mmol/L時(shí)會(huì)影響IHA結(jié)果的準(zhǔn)確性，在試驗(yàn)中出現(xiàn)高血脂血清進(jìn)行IHA檢測(cè)時(shí)，必要的預(yù)處理可能去除血脂對(duì)IHA結(jié)果的干擾[7]，或重新采血復(fù)查，以消除其對(duì)結(jié)果的影響。

綜上上述，在IHA試驗(yàn)中,只有明確樣品中干擾因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，排除影響因素，才能獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。在本研究中模擬狀態(tài)下，顯示溶血、高血脂及抗凝樣本對(duì)IHA檢測(cè)結(jié)果均產(chǎn)生影響，血清膽紅素小于450μmol/L時(shí)對(duì)IHA結(jié)果無(wú)影響，因此在現(xiàn)場(chǎng)及臨床進(jìn)行IHA檢測(cè)時(shí)應(yīng)避免使用溶血和有抗凝劑的標(biāo)本，高血脂標(biāo)本需要復(fù)查結(jié)果。

[1]林丹丹,劉躍民,胡飛,等.中國(guó)日本血吸蟲(chóng)病常用診斷方法現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值的分析與評(píng)估 [J].I.IHA篩查法評(píng)估血吸蟲(chóng)病疫區(qū)人群感染率的評(píng)價(jià)[J].中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志,2008,20(3):179-183.

[2]許靜,馮婷,郭家綱,等.我國(guó)幾種日本血吸蟲(chóng)病免疫診斷試劑的綜合測(cè)評(píng)[J].中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志，2005，17(2)：116-119.

[3]陳健康,肖祥.溶血等因素對(duì)血吸蟲(chóng)抗體檢測(cè)影響的實(shí)驗(yàn)觀察[J].安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,1999,5(4):374-375.

[4]孫輝,趙佳強(qiáng),孫鋼,等.內(nèi)源性疑似干擾物對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果的影響[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2011,38(5):543-544.

[5]鄒映紅.抗壞血酸、膽紅素、血紅蛋白、乳糜對(duì)臨床生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的影響[J].浙江臨床醫(yī)學(xué),2012,14(2).

[6]葉應(yīng)嫵,王毓三.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].第2版.南京：東南大學(xué)出版社,1997:263.

[7]陳年高,林丹丹,謝曙英,等.日本血吸蟲(chóng)間接血凝試驗(yàn)診斷試劑盒臨床診斷效能[J].中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志,2011,23(4):377-379.

[8]李軍宏,汪天平,肖祥,等.血吸蟲(chóng)病中度流行區(qū)化療對(duì)象篩查方案的研究[J].中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志,2002,14(6):418-421.

[9]張?jiān)?王薇,周平標(biāo).標(biāo)本溶血對(duì) TP、AST測(cè)定的干擾及糾正[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),2004,22(1):79.

[10]張愛(ài)華,王小芳,陳桂蘭.溶血對(duì)常見(jiàn)生化指標(biāo)的影響及其校正方法的探討[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2014,32(4):491-492.

[11]中華心血管雜志編輯委員會(huì),血脂異常防治對(duì)策專(zhuān)題組.血脂異常防治建議[J].中華心血管雜志,1997,25(3):1206-1252.

[12]朱艷華,張慧敏.脂血對(duì)檢測(cè)HBV DNA的影響及解決辦法[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志,2009,41(10):1214-1215.