硒蛋白X基因克隆、定點(diǎn)突變、原核表達(dá)及多克隆抗體制備

趙 華湯加勇曹 蕾周繼昌賈 剛劉光芒陳小玲王康寧（.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，成都630；.深圳市慢性病防治中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，深圳5800）

硒蛋白X基因克隆、定點(diǎn)突變、原核表達(dá)及多克隆抗體制備

趙 華1湯加勇1曹 蕾1周繼昌2賈 剛1劉光芒1陳小玲1王康寧1
（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，成都611130；2.深圳市慢性病防治中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，深圳518020）

摘 要:本試驗(yàn)旨在克隆鑒定豬硒蛋白X（SelX）基因，將其定點(diǎn)突變后進(jìn)行原核表達(dá)，獲得重組蛋白，并制備豬SelX多克隆抗體，為以豬為模型SelX功能研究奠定基礎(chǔ)。利用cDNA末端快速克?。?′?RACE）技術(shù)從豬肝臟總RNA擴(kuò)增出含開放閱讀框（ORF）至poly（A）共1 215 bp的SelX基因cDNA片段，其348 bp的ORF編碼區(qū)和對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基與人相應(yīng)序列分別有88% 和91%序列同源性，豬SelX基因提交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號(hào)為EF113597。ORF編碼氨基酸殘基中硒代半胱氨酸（Sec）位于C－端第95個(gè)殘基，其編碼密碼子TGA經(jīng)定點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼幔–ys）的TGT后，將其插入載體pET30，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中，在0.5 mmol/L異丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)2 h獲得融合表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)His?tag親和層析后，獲得分子質(zhì)量為18.0 ku的純化蛋白。將純化獲得的SelX基因突變體融合蛋白（SelXm）免疫兔子，得到效價(jià)高達(dá)1∶20 000的多克隆抗體，免疫印跡（Western?blot）結(jié)果顯示該抗體能特異性識(shí)別純化的SelXm和豬肝臟中相應(yīng)SelX。本試驗(yàn)成功克隆并鑒定了豬SelX基因，并制備了其多克隆抗體。關(guān)鍵詞:豬SelX基因；克隆；定點(diǎn)突變；原核表達(dá)；多克隆抗體

目前在人和鼠中已經(jīng)通過試驗(yàn)探明了部分硒蛋白的功能，但大部分硒蛋白生物學(xué)功能尚不清楚，當(dāng)中包括硒蛋白X（SelX）。研究發(fā)現(xiàn)SelX基因的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物組織分布廣泛，尤其在肝臟、白細(xì)胞等中表達(dá)量較高［5］。豬與人類在生理結(jié)構(gòu)和功能上具有多方面的相似性，這些相似性使豬成為人類一些疾病的理想動(dòng)物模型［6］，以豬為模型研究SelX生物學(xué)功能具有重要意義。在此本試驗(yàn)擬克隆豬SelX基因，并對(duì)其Sec密碼子進(jìn)行定點(diǎn)突變后，構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)SelX基因突變體蛋白（SelXm），制備豬SelXm多克隆抗體，為進(jìn)一步以豬為模型研究SelX生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、菌株及質(zhì)粒

健康成年雄性家兔2只（體重2.0～2.5 kg），購自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)，克隆載體pMD18?T購自寶生物工程（大連）有限公司，大腸桿菌TOP10、原核表達(dá)載體pET30，大腸桿菌BL21 （DE3）等由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

DNA限制性內(nèi)切酶、AMV第1鏈cDNA合成試劑盒、T4 DNA連接酶、pfu Taq DNA聚合酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、3′－full RACE core set、定點(diǎn)突變?cè)噭┖芯徸詫毶锕こ蹋ù筮B）有限公司；總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、快速質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自O(shè)mega公司；瓊脂糖購自Biowest公司；胰蛋白胨和酵母提取物均為OXOID公司產(chǎn)品；His?tag凝膠層析介質(zhì)購自GE公司產(chǎn)品；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 SelX基因克隆與分析

通過NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫查詢豬表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs），獲得1段與與人SelX基因具有同源性的序列（GeneBank登錄號(hào):CV874267），根據(jù)該序列設(shè)計(jì)cDNA末端快速克?。?′?RACE）上游引物F1:5′－AGGCTCAAGACCCTGCGGTGGA－3′，與3′?full RACE core set試劑盒里的3′－adaptor primer構(gòu)成引物對(duì)，擴(kuò)增含完整3′－端全長(zhǎng)的SelX基因。新鮮采取長(zhǎng)白豬肝臟組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，檢測(cè)其質(zhì)量合格后，用于克隆SelX基因。以總RNA為模板，以O(shè)ligo（dT）－3′?site Primer為引物，按3′?full RACE core set試劑盒操作合成第1鏈cDNA。再以F1和3′?adaptor primer組成引物對(duì)，以合成的第1鏈cDNA為模板擴(kuò)增獲得含完整ORF至poly（A）的SelX基因序列。PCR反應(yīng)條件為:94℃初始變性5 min，然后經(jīng)過35個(gè)循環(huán)（94℃30 s，58℃30 s，72℃1.5 min），然后72℃延伸10 min結(jié)束，4℃保存。采用T/A克隆將擴(kuò)增片段連接到pMD18?T載體，采用藍(lán)白篩選方法篩選陽性克隆，經(jīng)PCR驗(yàn)證后進(jìn)一步將獲取的目的DNA送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。本試驗(yàn)中分子生物學(xué)操作參照相應(yīng)試劑盒說明和《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》［7］。利用NCBI Blast、SECISearch 2.18等在線分析軟件對(duì)克隆的DNA序列進(jìn)行序列分析，確認(rèn)后提交NCBI Gen?Bank。

電力電纜設(shè)備的運(yùn)行管理是個(gè)全面的過程，在整個(gè)過程中，需要注>意的是做好電纜以及附件的處理工作，在設(shè)備運(yùn)行管理中，成本管理是關(guān)鍵。尤其是敷設(shè)的電纜設(shè)備的管理中，提前實(shí)施檢測(cè)和管理。

1.4 SelX基因定點(diǎn)克隆、原核表達(dá)載體構(gòu)建

以克隆的SelX?pMD18?T質(zhì)粒為模版，在SelX基因的ORF內(nèi)Sec密碼子TGA附近設(shè)計(jì)突變引物突變引物MX?F:5′－TCAGCAGTTCCCT?GAAGTTCATC－3′和MX?R:5′－ATATACA?GAAGCGGGACTGTCC－3′，應(yīng)用反向PCR技術(shù)，利用突變引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)SelX基因?qū)崿F(xiàn)定點(diǎn)突變，將密碼子由TGA突變成TGT。按定點(diǎn)突變?cè)噭┖校═aKaRa）操作說明進(jìn)行突變PCR、Blunting Kination反應(yīng)和連接（Ligation）反應(yīng)。電轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞涂布LB平板（含青霉素），37℃過夜培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證。

根據(jù)SelX基因的ORF設(shè)計(jì)EX?F:5′－ATATCGGATCCATGTCGTTCTGCAGCTTC－3′（引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)）和Ex?R:5′－GCCG?CAAGCTTGCTACTGTCCCTGGGAGG－3′（引入HindⅢ酶切位點(diǎn)）引物對(duì)，用于PCR擴(kuò)增和原核表達(dá)載體構(gòu)建。以上述突變SelX基因重組質(zhì)粒為模板，pfu Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)過乙醇沉淀回收并測(cè)定濃度，分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切處理。同時(shí)對(duì)pET30質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切處理，PCR產(chǎn)物和pET30質(zhì)粒經(jīng)雙酶切處理后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收相應(yīng)目的DNA和質(zhì)粒酶切片段。DNA片段與相應(yīng)酶切線性化處理的pET30載體采用T4 DNA連接酶于16℃過夜連接，用Qiagen PCR回收試劑盒回收連接片段后用于電轉(zhuǎn)化。連接產(chǎn)物pET30?SelXm重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞細(xì)菌，涂布于新鮮LB平板，37℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行陽性克隆PCR篩選和雙酶切鑒定。構(gòu)建好的pET30?SelXm表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子，陽性菌落命名為pET30?SelXm/BL21。

1.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與目的蛋白質(zhì)純化

pET30?SelXm/BL21和陰性對(duì)照菌株pET30/BL21分別接種于20 mL的LB培養(yǎng)基中（含卡那霉素30 mg/L）37℃200～250 r/min懸浮培養(yǎng)過夜，次日按1%轉(zhuǎn)接至100 mL新的培養(yǎng)液中（含卡那霉素30 mg/L），當(dāng)OD600 nm為0.4時(shí)，加入0.5 mmol/L異丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。在誘導(dǎo)后1、2、3 h時(shí)取菌液1 mL于離心管中，4℃8 000×g離心10 min收集菌落，加入1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細(xì)菌，再次離心收集菌體，最后用50～100 μL蒸餾水調(diào)整各樣品菌樣濃度盡量一致。取20 μL菌樣，加入5 μL十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）上樣緩沖液，100℃煮沸10 min后，冰水放置5 min，樣品離心后，取20 μL用于12%SDS?PAGE檢測(cè)并分析重組蛋白表達(dá)量。根據(jù)電泳結(jié)果確定合適的誘導(dǎo)條件后，擴(kuò)大培養(yǎng)體積至1 L，收集菌樣用于目的蛋白純化，該蛋白記為SelXm。用于蛋白質(zhì)純化的菌體按加入裂解液［50 mmol/L Tris pH 8.0，10 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），0.1 mol/L氯化鈉（NaCl），0.25 mg/mL溶菌酶］，先冰浴超聲波粉碎菌體，然后37℃水浴2 h。12 000×g 4℃，離心10 min收集包涵體，用8 mmol/L尿素溶解后，調(diào)整溶液pH為7.4，NaCl 為0.5 mol/L，然后進(jìn)行Ni SepharoseTM親和層析，純化的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)入分子截留質(zhì)量3.5 ku透析袋透析后，分裝放－20℃保存。

1.6 多克隆抗體的制備及抗體效價(jià)測(cè)定

用純化的SelXm常規(guī)免疫家兔，每次免疫劑量為0.3 mg，溶于PBS中。首次免疫，將純化的蛋白質(zhì)加入等體積的弗氏完全佐劑，在渦旋振蕩儀中振蕩混勻，形成“油包水”狀乳懸液，充分乳化后采取背部多點(diǎn)皮下免疫注射，每點(diǎn)注射約100 μL。2周后用同樣劑量蛋白質(zhì)與等體積的弗氏不完全佐劑混合后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。后每隔10 d，進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行2次加免。最后1次加強(qiáng)免疫后6 d，頸靜脈采血，制備血清。以家兔免疫前耳靜脈采集的血清作為陰性對(duì)照。

用抗原包被液（pH 9.6）稀釋純化蛋白質(zhì)濃度為2 μg/mL，取100 μL純化蛋白質(zhì)（抗原）液置于96孔酶標(biāo)板中，37℃放置過夜。然后用PBS－吐溫（PBST）洗滌酶標(biāo)孔3次，加入封閉液200 μL/孔于酶標(biāo)板中，置37℃封閉1～2 h。用PBST洗滌酶標(biāo)孔3次后，每孔加入稀釋的待測(cè)樣品抗血清（1∶500、1∶1 000、1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000），以免疫前的血清作為相應(yīng)陰性對(duì)照，加蓋37℃孵育2 h。PBST洗滌酶標(biāo)板3次后，每孔100 μL加封閉液稀釋的辣根過氧化物（HRP）標(biāo)記山羊抗兔酶標(biāo)抗體（1∶2 500倍稀釋），37℃孵育1 h。PBST洗滌3次后，每孔加入100 μL新鮮配制的四甲基聯(lián)苯胺（TMD）底物顯示液，置暗處反應(yīng)20 min。用100 μL/孔2 mmol/L H2SO4終止反應(yīng)后，置于酶標(biāo)儀中，在450 nm波長(zhǎng)讀數(shù)。若待測(cè)孔OD450 nm大于或等于陰性對(duì)照孔的2.1倍，即認(rèn)為是陽性值，從而得出血清的抗體效價(jià)。

將純化的SelXm融合蛋白及空載體進(jìn)行SDS?PAGE后，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）分析，用半干法電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉后，以本試驗(yàn)制備的兔抗血清（1∶10 000）為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶2 000）為二抗進(jìn)行反應(yīng)。顯色反應(yīng)參照Millpore公司的ECL化學(xué)發(fā)光底物說明書進(jìn)行，底片曝光操作參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》［7］。同時(shí)對(duì)豬肝臟樣品提取總蛋白，進(jìn)行SDS?PAGE電泳后，進(jìn)行Western?blot分析，檢測(cè)制備的兔抗血清是否對(duì)肝臟中SelX具有免疫原性。

2　結(jié)果與分析

2.1 SelX基因克隆與分子生物學(xué)分析

以豬肝臟總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成第1 鏈cDNA片段。利用F1引物，采用3′－RACE方法，擴(kuò)增出了1條1 215 bp的目標(biāo)基因片段（圖1－A）。擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)T/A克隆后，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定確定，獲得了包含完整3′?UTR和ORF的SelX基因，經(jīng)NCBI Blast比對(duì)分析該基因ORF區(qū)長(zhǎng)348 bp，編碼116個(gè)氨基酸殘基，豬SelX Sec殘基位于C－端第95個(gè)殘基，ORF編碼區(qū)與人SelX基因ORF區(qū)有88%序列同源性，編碼的蛋白質(zhì)序列與人SelX具有91%序列同源性（圖1－B）。豬SelX基因提交NC?BI GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號(hào)為:EF113597。SelX基因經(jīng)SECISearch 2.18軟件分析，具有典型的硒蛋白特有的3′?UTR SECIS發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖1－C）。采用SingalP 3.0在線軟件（www.cbs.dtu.dk/serv?ices/singalP/）對(duì)克隆的豬SelX基因進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示SelX沒有信號(hào)肽切割位點(diǎn)。

圖1　豬SelX的基因克隆及其蛋白氨基酸序列和基因序列分析Fig.1 Gene cloning，protein and gene sequence analysis of porcine SelX

2.2 SelX基因定點(diǎn)突變及原核表達(dá)載體構(gòu)建

構(gòu)建好的表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果顯示Sec的編碼密碼子TGA突變成TGT（圖2－A），TGA在原核表達(dá)系統(tǒng)中是1個(gè)終止密碼子經(jīng)過突變成TGT后，可以在原核系統(tǒng)中表達(dá)目的蛋白。突變體表達(dá)載體pET30?SelXm轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞，隨機(jī)挑選3個(gè)陽性轉(zhuǎn)化，采用菌落PCR，以EX?F和EX?R引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出分子質(zhì)量約為360 bp大小的DNA片段（圖2－B），與預(yù)期DNA片段大小一致，說明突變基因原核表達(dá)載體構(gòu)建并轉(zhuǎn)化成功。

2.3 SelX基因原核表達(dá)、純化及抗體效價(jià)測(cè)定

pET30?SelXm/BL21經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)表達(dá)出目的蛋白，空載質(zhì)粒pET30/BL21誘導(dǎo)后不能表達(dá)目的蛋白（圖3－A），經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2 h即可獲得理想的目的蛋白表達(dá)量。表達(dá)的蛋白經(jīng)過His?tag親和層析，得到純化的目的蛋白，SDS?PAGE顯示分子質(zhì)量約為18.0 ku（圖3－A）。

純化的SelX基因突變體融合蛋白免疫家兔，經(jīng)加強(qiáng)免疫后，頸部靜脈采集血液，室溫放置1 h，放入4℃冰箱過夜，制備抗血清。采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法測(cè)定多克隆抗體效價(jià)，以免疫前兔血清作為對(duì)照，結(jié)果顯示，經(jīng)過免疫后，制備的抗血清效價(jià)高達(dá)1∶20 000（表1），利用免疫印跡（Western?blot）方法檢測(cè)表明，所獲得的多克隆抗體能與純化的SelXm特異性結(jié)合（圖3－A），制備的多克隆抗體（抗血清）與肝臟中的SelX具有交差反應(yīng)（圖3－B）。

3　討 論

未知序列基因克隆方法有很多種，可以根據(jù)不同物種之間基因序列同源性比較，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得部分基因片段信息，在此基礎(chǔ)上采用采用5′?RACE和3′?RACE等方法，獲得基因的完整序列信息［8］。隨著豬ESTs數(shù)據(jù)庫等生物信息數(shù)據(jù)庫的急劇豐富，通過查詢目標(biāo)基因ESTs信息，在此基礎(chǔ)上采用5′?RACE和3′?RACE等方法克隆獲得基因片段，成為克隆新基因的強(qiáng)有力手段［9］。本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)ESTs生物信息學(xué)分析結(jié)合3′?RACE等技術(shù)手段成功分離克隆出包含完整ORF和3′－側(cè)翼序列的SelX基因序列片段，并將基因序列提交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫（GenBank登錄號(hào):EF113597），分析SelX基因ORF片段在豬和人之間的序列同源性發(fā)現(xiàn)，CDS編碼區(qū)與人SelX基因CDS區(qū)有88%序列同源性（圖1－B），編碼的蛋白序列與人SelX具有91%序列同源性。SE?CISearch 2.18在線生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，克隆的SelX基因3′?UTR具有典型的硒蛋白特有的3′?UTR SECIS發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖1－C）。信號(hào)肽分析顯示豬SelX沒有信號(hào)肽切割位點(diǎn)，預(yù)示著SelX為孢內(nèi)蛋白，可能定位于細(xì)胞質(zhì)。

圖2　SelX基因Sec密碼子突變及其重組表達(dá)載體鑒定Fig.2 Identification of site?directed mutagenesis of Sec codon and recombinant expression plasmids of SelX gene

高等哺乳動(dòng)物中體內(nèi)要識(shí)別硒蛋白基因ORF 中TGA為Sec密碼子，除了需要SECIS外，還需要一套復(fù)雜的識(shí)別機(jī)制，需要SECIS識(shí)別蛋白（SPS 2）、轉(zhuǎn)運(yùn)Sec的tRNA（Sec?tRNASec）等因子參與［10］。原核細(xì)胞缺乏相應(yīng)的識(shí)別機(jī)制，因此高等哺乳動(dòng)物來源的硒蛋白不能直接在原核系統(tǒng)中表達(dá)，由于Sec和半胱氨酸（Cys）性質(zhì)很相似，因此通過定點(diǎn)突變將Sec密碼子突變成Cys密碼子，可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)硒蛋白類似物，表達(dá)的突變體蛋白由于相應(yīng)Cys位點(diǎn)不含硒，因而不具有硒蛋白生物學(xué)活性，但由于二者蛋白質(zhì)氨基酸序列基本一致，因而具有相應(yīng)的免疫原性，可通過硒蛋白類似物來制備其對(duì)應(yīng)硒蛋白抗體。周繼昌等［11］對(duì)豬硒蛋白Sep15基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后，成功表達(dá)了Sep15突變蛋白，免疫兔子后成功制備了豬Sep15抗血清。本試驗(yàn)采用快速PCR定點(diǎn)突變方法成功地對(duì)SelX基因進(jìn)行了單堿基定點(diǎn)突變（圖2－A）。通過在待突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)突變引物（2引物5′端相鄰）直接以雙鏈DNA為模板，以突變引物進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，得到含平末端的PCR產(chǎn)物，末端進(jìn)行磷酸化處理后，在DNA連接酶的作用下得到含目的片段的環(huán)狀雙鏈DNA，轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主菌后即可快速篩選出含突變基因的轉(zhuǎn)化子［12－13］。SelX基因突變后，成功構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體，pET30?SelXm/BL21轉(zhuǎn)化子細(xì)胞在0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h成功表達(dá)了SelXm（圖3）。本試驗(yàn)采用pET30表達(dá)載體對(duì)豬SelX基因突變體蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，表達(dá)載體N－端含有1個(gè)6個(gè)組氨酸串聯(lián)的His?tag，便于目的蛋白分離純化，經(jīng)過His?tag介質(zhì)親和層析，得到了純化的目的蛋白，分子質(zhì)量約為18.0 ku（圖3－A）。

SelX屬于蛋氨酸亞砜還原酶家族一員，該類蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)將氧化狀態(tài)的蛋氨酸亞砜（MetSO）還原成蛋氨酸殘基，從而在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要生物學(xué)功能。蛋氨酸亞砜還原酶家族包含MsrA和MsrB，目前在人體內(nèi)已經(jīng)鑒定出4種MsrB，SelX屬于MsrB［14］，但目前其生物學(xué)功能尚不清楚。我們?cè)谝载i為模型的研究中發(fā)現(xiàn)SelX基因表達(dá)量在肝臟、腎臟、肌肉、垂體、甲狀腺和下丘腦等組織中不受飼糧硒水平（缺硒和高營(yíng)養(yǎng)劑量硒）影響［15］，這可能預(yù)示這SelX在這些組織中具有重要功能，機(jī)體在硒營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)發(fā)生改變時(shí)優(yōu)先保障其穩(wěn)定表達(dá)從而保證其重要功能發(fā)揮。但對(duì)于SelX蛋白表達(dá)是否受缺硒或過量硒水平影響尚不清楚，本試驗(yàn)用純化SelXm免疫家兔制備抗豬SelX的多克隆抗體，經(jīng)間接ELISA檢測(cè)表明，制備的抗血清效價(jià)高達(dá)1∶20 000以上（表1）；利用Wersten?blot方法檢測(cè)表明，所獲得的多克隆抗體能與純化的SelXm融合蛋白特異性結(jié)合，同時(shí)也能識(shí)別豬肝臟中的SelX。因此本試驗(yàn)制備的多克隆抗體也可望用于檢測(cè)SelX蛋白表達(dá)，為今后以豬為模型從從蛋白水平探討SelX功能奠定了基礎(chǔ)。

圖3　SelX融合蛋白的SDS?PAGE分析和Western blot檢測(cè)Fig.3 SDS?PAGE analysis of expressed fusion protein SelX and Western blot assay for the purified protein

表1　間接ELISA檢測(cè)豬SelXm多克隆抗體效價(jià)Table 1 The polyclonal antibody titer of porcine SelXm determined by indirected ELISA

4　結(jié) 論

本試驗(yàn)成功克隆了豬SelX基因并對(duì)其序列進(jìn)行比對(duì)分析（基因序列提交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號(hào)為:EF113597）；對(duì)其編碼密碼子TGA經(jīng)定點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼幔–ys）的TGT后，成功實(shí)現(xiàn)了SelX基因突變體蛋白在大腸桿菌中表達(dá)；表達(dá)的蛋白經(jīng)純化后，免疫家兔，獲得了效價(jià)高達(dá)1∶20 000的多克隆抗體；Western?blot顯示制備的抗血清能特異性識(shí)別純化的SelXm和豬肝臟組織中的SelX，可用于豬組織SelX的Western?blot分析。

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Author，ZHAO Hua，associate professor，E?mail:zhua666＠126.com

（責(zé)任編輯 王智航）

Gene cloning，Site?directed Mutagenesis，Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of Porcine Selenoprotein X

ZHAO Hua1TANG Jiayong1CAO Lei1ZHOU Jichang2JIA Gang1LIU Guangmang1CHEN Xiaoling1WANG Kangning1
（1.Animal Nutrition Institute，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2.Molecular Biology Lab，Shengzhen Center for Chronic Disease Control，Shenzhen 518020，China）

Abstract:The objective of this experiment was to clone，site?directed mutate，prokaryotic express porcine sel?enoprotein X（SelX）and prepare its polyclonal antibody for further study of its roles using pig models.Total RNA was extracted from porcine liver for 3′?RACE，and a 1 215 bp cDNA fragment of the SelX containing se?quence from the open reading frame（ORF）till to its poly（A）tail was isolated.The 384 bp ORF share an 88%identity to that of human，while their amino acid sequences had 91%identity.The sequence of porcine SelX was submitted to NCBI GenBank with accession number of EF113597.The selenocysteine（Sec）encoded by TGA codon was located in the 95th amino acid position near the C?terminal of SelX.The codon TGA for Sec was site?directed mutated into TGT for cysteine（Cys），then the mutant was cloned into pET30 vector and expressed in E.coli BL21（DE3）induced by 0.5 mmol/L isopropy?β?D?thiogalactoside（IPTG）for 2 hours.The expressed recombinant protein exhibited a molecular weight of approximately 18.0 ku after purified using Ni Sepharose affinity column.The purified SelX mutant protein（SelXm）was used to immunize rabbit and the obtained polyclonal anti?sera showed a 1∶20 000 titer.Western?blot assay showed the rabbit anti?sera exhibited a specific immune recognization against the purified SelXm fusion protein and SelX in porcine liver tissue.In conclusion，the porcine SelX gene is successfully cloned and identified，and also its polyclonal antibody is suc?cessfully prepared in the present study.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（5）:1485?1491］

Key words:porcine SelX gene；cloning；site?directed mutagenesis；prokaryotic expression；polyclonal anti?body

中圖分類號(hào):S828

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1006?267X（2015）05?1485?07

作者簡(jiǎn)介:趙 華（1974—），男，四川雅安人，副研究員，博士，主要研究領(lǐng)域?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與分子生物學(xué)。E?mail:zhua666＠126.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31072043，31272468）；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雙支計(jì)劃

收稿日期:2014－11－30

doi:10.3969/j.issn.1006?267x.2015.05.019