不同處理水稻秸稈對(duì)體外瘤胃發(fā)酵模式、甲烷產(chǎn)量和微生物區(qū)系的影響

辛杭書(shū) 劉凱玉 張永根 王明君 李仲玉 王志博 潘春方 李欣新 劉可園

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030)

甲烷是除二氧化碳(CO2)以外最主要的溫室氣體之一。據(jù)政府間氣候變化專門(mén)委員會(huì)(IPCC)統(tǒng)計(jì)，畜牧業(yè)排出的溫室氣體占8% ～10.8%，尤其是反芻動(dòng)物養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)［1］。而在各種溫室氣體中，甲烷的溫室效應(yīng)潛勢(shì)遠(yuǎn)大于CO2，但由于其存在時(shí)間低于CO2，可以作為優(yōu)先減排對(duì)象［2］。研究表明，通過(guò)改良飼糧組分可以有效降低反芻動(dòng)物溫室氣體的排放量，進(jìn)而減緩環(huán)境惡化的趨勢(shì)［3］。

水稻秸稈是反芻動(dòng)物重要的粗飼料原料之一，加工處理后的水稻秸可以有效減少動(dòng)物的甲烷排放量。華金玲等［4］研究表明，經(jīng)過(guò)青貯和氨化處理的水稻秸稈能顯著降低反芻動(dòng)物的甲烷排放量。然而，青貯或氨化處理降低甲烷產(chǎn)量的機(jī)理如何，是否是通過(guò)影響瘤胃微生物區(qū)系這一途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，此類(lèi)研究還鮮有報(bào)道。針對(duì)這一問(wèn)題，設(shè)計(jì)了本試驗(yàn)，通過(guò)體外產(chǎn)氣法，研究不同處理水稻秸稈(青貯、氨化和堿化)對(duì)甲烷生成、瘤胃發(fā)酵模式以及瘤胃微生物區(qū)系的影響，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)方法對(duì)甲烷生成相關(guān)的微生物群落，如甲烷菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、原蟲(chóng)、真菌等進(jìn)行相對(duì)定量分析，旨在探究各處理的水稻秸稈對(duì)甲烷產(chǎn)生的影響是否通過(guò)改變某些微生物區(qū)系來(lái)實(shí)現(xiàn)的，為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 不同處理水稻秸稈的制備

由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊農(nóng)場(chǎng)提供優(yōu)質(zhì)的水稻秸稈［干物質(zhì)(DM)32%］，切割成為2～3 cm長(zhǎng)度后，分別對(duì)其進(jìn)行不同的加工處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)制作5 kg。

青貯秸稈:選用復(fù)合乳酸菌制劑(1×105CFU/g)，按秸稈DM的8%進(jìn)行噴灑添加，充分混合，使其含水量達(dá)到75%(每5 kg秸稈中菌劑水溶液的添加量約為1.4 kg)，在青貯袋中壓實(shí)并密封，青貯處理45 d。復(fù)合乳酸菌制劑由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供，主要由植物乳酸菌(L.plantarum)、布氏乳桿菌(L.buchneri)和干酪乳桿菌(L.casei)構(gòu)成。

氨化秸稈:將新鮮秸稈晾曬至其含水量達(dá)到30%，然后將秸稈DM 5%的尿素溶于水中(每5 kg秸稈中尿素水溶液的添加量約為1.4 kg)，均勻地噴灑于秸稈上，使其含水量達(dá)到45%，然后裝入塑料袋中并密封，氨化處理30 d。

堿化秸稈:將新鮮秸稈晾曬至其含水量達(dá)到30%，取秸稈DM 4%的氫氧化鈉溶于水中(每5 kg秸稈中氫氧化鈉水溶液的添加量約為0.8 kg)，均勻地噴灑于秸稈上，使其含水量達(dá)到40%，裝入塑料袋中并密封，堿化處理7 d。

未處理干秸稈:晾曬至風(fēng)干樣，作為對(duì)照。

1.2 體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量和瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定

體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的測(cè)定采用 Menke等［5］及Schofield等［6］方法進(jìn)行。瘤胃液取自3頭裝有永久性瘤胃瘺管的健康奶牛，于晨飼2 h后由瘤胃的不同位點(diǎn)采集瘤胃液，裝入事先預(yù)熱并通入CO2的保溫瓶中，立即蓋嚴(yán)瓶口，迅速返回實(shí)驗(yàn)室。將采集的瘤胃液充分混合后經(jīng)4層紗布過(guò)濾(在39℃溫水浴中進(jìn)行，通入CO2，保持厭氧環(huán)境)，按比例與緩沖液混合后(瘤胃液∶緩沖液=1∶2，體積比)，利用瓶口分配器迅速分裝(30 mL)至已預(yù)熱好，通有CO2并裝有0.200 0 g(DM 基礎(chǔ))發(fā)酵底物的培養(yǎng)瓶中。其中緩沖液參照Menke等［5］的方法進(jìn)行配制。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，3個(gè)空白(只裝有瘤胃液與緩沖液)。發(fā)酵裝置主體為HZS-H型恒溫水浴搖床，其水浴溫度和振蕩速率均可調(diào);培養(yǎng)單位是用容積約100 mL的培養(yǎng)瓶，其上安裝有帶塑料管的橡皮塞，用于密封培養(yǎng)瓶;塑料管上帶有可調(diào)開(kāi)關(guān)的三通閥以保證厭氧發(fā)酵環(huán)境;三通閥與醫(yī)用玻璃注射器(可計(jì)量容積為50 mL)相連。注射器每次使用之前須洗凈、烘干，然后用少量液體石蠟涂在活塞筒的四周，以防漏氣，并可減少氣體產(chǎn)生過(guò)程中活塞向上移動(dòng)的阻力。記錄 1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、20、24、32、36、40、48 和 72 h 的產(chǎn)氣量，并在 4、8、12、16、24、48和72 h用氣體樣品袋收集氣體，立即測(cè)定甲烷產(chǎn)量［7］。在發(fā)酵24 h后，迅速測(cè)定培養(yǎng)液中的pH(sartorius PB－10型酸度計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，然后取10 mL培養(yǎng)液以測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的含量。甲烷產(chǎn)量及VFA濃度的測(cè)定均采用島津GC－2010氣相色譜儀進(jìn)行，其中甲烷產(chǎn)量測(cè)定時(shí)的色譜條件為:熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD);填充柱TDX－01色譜柱;測(cè)定條件為柱溫150℃，檢測(cè)器180℃，進(jìn)樣口溫度180℃;載氣為氮?dú)?N2)，流速30 mL/min;進(jìn)樣量200 μL。VFA濃度測(cè)定時(shí)的色譜條件為:汽化室參數(shù)為載氣 N2，分流比40∶1，進(jìn)樣量0.4 μL，溫度 220℃;色譜柱參數(shù)為HP-INNOWax毛細(xì)管色譜柱恒流模式，流量2.0 mL/min，平均線速度38 cm/s;柱溫箱參數(shù)為程序升溫 120℃(3 min)——10℃/min——180℃(1 min);檢測(cè)器參數(shù)為氫氣(H2)流量 40 mL/min，空氣流量 450 mL/min，柱流量+尾吹氣流量45 mL/min，火焰離子檢測(cè)器(FID)溫度250℃。另取10 mL培養(yǎng)液快速轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱內(nèi)保存，用于微生物DNA的提取。

1.3 瘤胃微生物總DNA的提取

采用珠磨－十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法［8］提取瘤胃微生物總DNA。提取后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定提取的總DNA濃度和純度，樣品的 OD260nm與 OD280nm比值應(yīng)在 1.6～1.8之間(平均在1.75左右)，且用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的總DNA在加樣孔附近呈現(xiàn)一致密亮帶時(shí)，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)微生物相對(duì)數(shù)量

從瘤胃微生物總DNA中擴(kuò)增真細(xì)菌16S rDNA。PCR反應(yīng)體系:10×緩沖液 2μL，10 mmol/L的 dNTP 0.4 μL，10 μmol/L 的引物各0.8 μL，25 mmol/L 的 MgCl21.6 μL，模板(瘤胃總 DNA)0.4 μL，TaqDNA 聚合酶2 μL，ddH2O 為13.6μL，總體積為20μL。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃變性7 min;95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 3 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。RT-PCR的引物參照Denman等［9］報(bào)道的瘤胃總細(xì)菌、甲烷菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和真菌引物序列［表1，由上海生工生物工程(上海)股份有限公司］。所用儀器為ABI7500型RT-PCR儀，RT-PCR的反應(yīng)條件參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑建立25μL反應(yīng)體系。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR［9］

1.5 計(jì)算公式

根據(jù)下面公式將瘤胃微生物相對(duì)數(shù)量表示為相對(duì)于瘤胃總細(xì)菌16S rDNA的百分比:

目標(biāo)菌相對(duì)數(shù)量(%)=2－(Ct目標(biāo)菌－Ct總細(xì)菌)×100［3］。

式中:Ct目標(biāo)菌為以目標(biāo)菌引物所測(cè)的 Ct值，Ct總細(xì)菌為以總細(xì)菌為引物所得的Ct值。

采用下列模型計(jì)算動(dòng)態(tài)產(chǎn)氣參數(shù):y=B ×［1 － e－c×(t－lag)］。

式中:y為t時(shí)間點(diǎn)0.200 0 g底物DM 的產(chǎn)氣量(mL)，B為0.200 0 g底物DM 理論最大產(chǎn)氣量(mL)，c為樣本的產(chǎn)氣速度(h－1)，t為體外培養(yǎng)時(shí)間(h)，lag為產(chǎn)氣延滯期(h)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel初步記錄并做簡(jiǎn)單處理，利用7500 System Software分析RT-PCR結(jié)果。然后采用SAS 9.1軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并用混合模型(mixed procedure)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同處理水稻秸稈對(duì)72 h產(chǎn)氣量及甲烷產(chǎn)量的影響

由表2可知，與未處理的干秸稈相比，不同處理方法可顯著提高秸稈72 h體外培養(yǎng)的產(chǎn)氣量(P＜0.05)，青貯、氨化和堿化處理分別將產(chǎn)氣量提高了 5.62%、9.37%和 21.38%。甲烷產(chǎn)量的變化趨勢(shì)與產(chǎn)氣量相似，各處理秸稈的甲烷產(chǎn)量由高到低依次為堿化秸稈、氨化秸稈、青貯秸稈和干秸稈，其中堿化處理效果顯著(P＜0.05)。堿化秸稈的產(chǎn)氣速度最快，顯著高于其他3種秸稈(P＜0.05)。秸稈經(jīng)青貯處理后，其產(chǎn)氣延滯期顯著低于其他3種秸稈(P＜0.05)，干秸稈、氨化秸稈和堿化秸稈之間的差異不顯著(P＞0.05)。在72 h體外培養(yǎng)過(guò)程中，產(chǎn)氣量的動(dòng)態(tài)變化參見(jiàn)圖1，在12 h之前，青貯秸稈產(chǎn)氣量最高，其他由高到低為堿化秸稈、氨化秸稈和干秸稈;而在12 h之后，堿化秸稈的產(chǎn)氣量一直處于最高水平，干秸稈最低，青貯和氨化秸稈居中。甲烷產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)與體外產(chǎn)氣量相似(圖2)。

表2 不同處理水稻秸稈對(duì)體外培養(yǎng)72 h產(chǎn)氣量及甲烷產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of different treated rice straws on rumen gas production and methane production after 72 h in vitro incubation

圖1 不同處理水稻秸稈的72 h體外產(chǎn)氣量的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 The dynamic change of gas production of different treated rice straws in 72 h

圖2 不同處理水稻秸稈的72 h體外甲烷產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 The dynamic change of methane production of different treated rice straws in 72 h

2.2 不同處理水稻秸稈對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表3可知，不同處理方法對(duì)水稻秸稈體外培養(yǎng)氨態(tài)氮(NH3-N)濃度有顯著的影響(P＜0.05)，其中氨化秸稈的NH3-N濃度最高，其次為青貯秸稈和堿化秸稈，而干秸稈的NH3-N濃度最低。與未處理的干秸稈相比，不論是青貯、氨化還是堿化，均顯著提高了體外培養(yǎng)的揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度(P＜0.05)，其中青貯秸稈和氨化秸稈顯著提高了丙酸的含量(P＜0.05)，降低了乙酸/丙酸(P＜0.05)，堿化秸稈與干秸稈具有相似乙酸/丙酸(P＞0.05)。而對(duì)于甲烷/TVFA而言，氨化秸稈顯著低于干秸稈和堿化秸稈(P＜0.05)。

2.3 不同處理水稻秸稈對(duì)瘤胃微生物區(qū)系的影響

由表4可知，與未處理的干秸稈相比，秸稈經(jīng)不同加工處理后，顯著影響了培養(yǎng)液中琥珀酸絲狀桿菌和甲烷菌相對(duì)數(shù)量(P＜0.05)，其中氨化和堿化處理顯著提高了瘤胃培養(yǎng)液中琥珀酸絲狀桿菌的相對(duì)數(shù)量(P＜0.05)，而氨化處理顯著降低了培養(yǎng)液中甲烷菌的相對(duì)數(shù)量(P＜0.05)，但各處理方式對(duì)瘤胃培養(yǎng)液中白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、真菌和原蟲(chóng)的相對(duì)數(shù)量沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)。

由圖5可知，不同處理的秸稈對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的瘤胃微生物區(qū)系有明顯的影響，并且各處理中的各種微生物相對(duì)數(shù)量均隨著時(shí)間的變化而變化，雖然變化規(guī)律并不是很一致，但均呈現(xiàn)一定的持續(xù)性。其中，各處理的白色瘤胃球菌隨著時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先升高后下降，再升高再下降的趨勢(shì)，但產(chǎn)生變化的時(shí)間各點(diǎn)略有不同。黃色瘤胃球菌和真菌則隨著時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。在12 h前，青貯秸稈培養(yǎng)液中琥珀酸絲狀桿菌的相對(duì)數(shù)量顯著高于干秸稈，其變化趨勢(shì)與黃色瘤胃球菌相似。對(duì)于甲烷菌而言，各處理后秸稈在12 h前相對(duì)穩(wěn)定，而在12 h后，呈現(xiàn)出先增加后下降，而后再增加再下降的趨勢(shì)，尤其是青貯秸稈，在12 h前幾乎沒(méi)有明顯的變化。各處理秸稈隨著時(shí)間的變化對(duì)原蟲(chóng)相對(duì)數(shù)量變化趨勢(shì)類(lèi)似，總體趨于增加，但變化幅度很小。

表3 不同處理水稻秸稈對(duì)體外培養(yǎng)24 h瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effects of different treated straws on rumen fermentation parameters after 24 h in vitro incubation

表4 不同處理水稻秸稈體外培養(yǎng)24 h的微生物區(qū)系的影響Table 4 Effects of different treated rice straws on microflora after 24 h in vitro incubation %

3 討論

體外發(fā)酵產(chǎn)氣量是衡量飼料可消化性的重要指標(biāo)之一，而產(chǎn)氣量與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率往往呈正相關(guān)性［10］，本試驗(yàn)選用的3種處理方法均顯著提高了體外發(fā)酵的產(chǎn)氣量，表明青貯、氨化及堿化均能一定程度上改善水稻秸稈的質(zhì)量，這與前人研究結(jié)果相一致［11－12］。這是由于對(duì)秸稈進(jìn)行處理后，能改變其纖維類(lèi)成分的相對(duì)含量，從而有利于瘤胃微生物的發(fā)酵［13］。而青貯處理后的秸稈，其體外發(fā)酵的產(chǎn)氣延滯期顯著低于其他3種秸稈，這可能由于青貯秸稈含有較高含量的有機(jī)酸和乳酸菌，從而縮短了秸稈的發(fā)酵產(chǎn)氣延滯期［14］。

通過(guò)青貯、氨化或堿化處理的秸稈的產(chǎn)氣量顯著高于干秸稈，說(shuō)明此3種處理能有效提高秸稈的消化率。而氨化秸稈的甲烷/TVFA最低，說(shuō)明甲烷能的損失量降低，這與前人的研究結(jié)果一致［15－16］。Getachew 等［17］通過(guò)體外發(fā)酵研究得出，飼料中的慢速降解部分能產(chǎn)生更多的甲烷。水稻秸稈通過(guò)氨化處理后，顯著降低了秸稈中性洗滌纖維(NDF)的含量，而NDF是生成乙酸的前體物質(zhì)，所以NDF含量的降低會(huì)使瘤胃發(fā)酵模式發(fā)生變化(由乙酸型轉(zhuǎn)向丙酸型發(fā)酵)，進(jìn)而使參與生成甲烷的底物H2有所減少。

經(jīng)過(guò)處理的水稻秸稈體外發(fā)酵后的NH3-N濃度都有明顯的增加，這是由于處理后的秸稈，其發(fā)酵能力提高，進(jìn)而使粗蛋白質(zhì)的降解速度加快［18］。其中氨化秸稈的培養(yǎng)液NH3-N濃度高于青貯秸稈和堿化秸稈，原因是氨化處理由于添加了氮源，為微生物發(fā)酵提供更多含量的含氮底物來(lái)生成NH3-N所致。

圖5 不同處理水稻秸稈對(duì)體外培養(yǎng)72 h微生物相對(duì)數(shù)量的影響Fig.5 Effects of different treated rice straws on microbe number during 72 h in vitro incubation

VFA是反芻動(dòng)物能量利用的主要形式，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，這3種酸約占瘤胃發(fā)酵VFA 總產(chǎn)量的95%［19－20］。在本試驗(yàn)中，3 種不同處理水稻秸稈的試驗(yàn)組中TVFA濃度均高于干秸稈，這可能由于青貯、青貯和氨化處理可以將秸稈的細(xì)胞壁變疏松，有利于微生物的發(fā)酵，進(jìn)而產(chǎn)生更多的VFA。并且，青貯秸稈和氨化秸稈的乙酸/丙酸有顯著降低，這也進(jìn)一步表明，這2種處理方法可通過(guò)降低乙酸/丙酸來(lái)降低甲烷的產(chǎn)量，這與Russell［21］和 Cao 等［16］報(bào)道結(jié)果相吻合。

瘤胃中的纖維降解細(xì)菌主要有黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌。Fernando等［22］研究發(fā)現(xiàn)在高粗飼糧條件下，琥珀酸絲狀桿菌為瘤胃發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌群。這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相似。尿素氨化處理提高了秸稈在瘤胃發(fā)酵中產(chǎn)生的琥珀酸絲狀桿菌相對(duì)數(shù)量，這與陳偉健等［23］研究結(jié)果一致。Wanapat等［24］采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)氨化處理后的水稻秸稈，顯著提高了瘤胃培養(yǎng)液中白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌的數(shù)量。然而，本試驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，這可能是由于體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)條件差異原因所產(chǎn)生不同的瘤胃內(nèi)環(huán)境條件所致。在培養(yǎng)前期，青貯秸稈能顯著提高琥珀酸絲狀桿菌的相對(duì)數(shù)量，琥珀酸絲狀桿菌在瘤胃發(fā)酵中的主要產(chǎn)物為乙酸和琥珀酸，并不產(chǎn)生H2。所以，青貯處理可能通過(guò)促進(jìn)不產(chǎn)氫菌的生長(zhǎng)來(lái)降低秸稈發(fā)酵中H2的產(chǎn)生，從而減少甲烷的生成［25］。

真菌在瘤胃纖維降解中同樣發(fā)揮重要的作用。Wood等［26］通過(guò)體外研究表明，瘤胃真菌和產(chǎn)甲烷菌對(duì)纖維的降解存在促進(jìn)作用，而甲烷菌的存在能改變瘤胃真菌的活性、改變發(fā)酵產(chǎn)物，使其趨于產(chǎn)生更多的乙酸、甲烷和CO2。本試驗(yàn)表明，在培養(yǎng)初期，青貯秸稈的培養(yǎng)液中真菌和甲烷菌的相對(duì)數(shù)量最低，表明青貯處理不利于甲烷菌和真菌的生長(zhǎng)。而真菌相對(duì)數(shù)量并不受處理?xiàng)l件的影響。

在16 h前青貯秸稈的培養(yǎng)液中，甲烷菌相對(duì)數(shù)量低于其他3種秸稈，這可能是由于青貯秸稈含較高的有機(jī)酸，致使甲烷菌的生長(zhǎng)受到抑制所致［27］。所以在體外培養(yǎng)初期，青貯秸稈的單位甲烷產(chǎn)量最低。而氨化秸稈降低了24 h體外發(fā)酵甲烷菌的相對(duì)數(shù)量，這與瘤胃培養(yǎng)液內(nèi)纖維類(lèi)物質(zhì)代謝有關(guān)。有研究表明，甲烷菌數(shù)量與秸稈中NDF的含量呈明顯的正相關(guān)性［28］。當(dāng)纖維類(lèi)物質(zhì)含量低時(shí)(如氨化秸稈)，培養(yǎng)底物發(fā)酵能力增強(qiáng)，甲烷生成底物H2的供給量相對(duì)充足，從而使甲烷的排放量增多;而對(duì)于干秸稈而言，由于纖維類(lèi)物質(zhì)含量高，通過(guò)增加甲烷菌數(shù)量來(lái)提高甲烷產(chǎn)量，進(jìn)而保持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

3種不同處理方法均沒(méi)有顯著影響秸稈發(fā)酵中瘤胃原蟲(chóng)相對(duì)數(shù)量，原蟲(chóng)在瘤胃中以細(xì)菌、真菌等為其主要捕食對(duì)象［29］，并且與甲烷菌存在共生關(guān)系。因此可以通過(guò)驅(qū)除原蟲(chóng)來(lái)減少甲烷菌，進(jìn)而降低甲烷的排放量［30］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，原蟲(chóng)相對(duì)數(shù)量與甲烷菌變化并不一致。

4 結(jié)論

①對(duì)水稻秸稈進(jìn)行青貯，、氨化和堿化處理，可以不同程度地改變體外瘤胃的發(fā)酵模式，甲烷生成以及瘤胃微生物區(qū)系的組成。

②從甲烷減排角度考慮，可選擇青貯和氨化的處理方式。

［1］ VELLINGA TH V，DE HAAN M H A，SCHILS R L M，et al.Implementation of GHG mitigation on intensive dairy farms:farmer’preferences and variation in cost effectiveness［J］.Livestock Science，2011，137(1/2/3):185－195.

［2］ 張博，陳國(guó)謙，陳彬.甲烷排放與應(yīng)對(duì)氣候變化國(guó)家戰(zhàn)略探析［J］.中國(guó)人口·資源與環(huán)境，2012，22(7):8－14.

［3］ VERMEULEN S J，AGGARWAL P K，AINSLINE A，et al.Options for support to agriculture and food security under climate change［J］.Environmental Science and Policy，2012，15(1):136 －144.

［4］ 華金玲，張永根，王立克，等.水稻秸青貯對(duì)反芻動(dòng)物甲烷排放的影響［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40(7):135－138.

［5］ MENKE K H，STEINGASS H.Estimation of energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid［J］.Animal Research and Development，1988，28:7 －55.

［6］ SCHOFIELD P，PELL A N.Measurement and kinetic analysis of the neutral detergent-soluble carbohydrate fraction of legumes and grasses［J］.Journal of Animal Science，1995，73(11):3455 －3463.

［7］ 胡偉蓮，王佳堃，呂建敏，等.瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)物中的甲烷和有機(jī)酸含量的快速測(cè)定［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2006，32(2):217 －221.

［8］ BüRGMANN H，PESARO M，WIDMER F，et al.A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil［J］.Journal of Microbiological Methods，2001，45(1):7 －20.

［9］ DENMAN S E，MCSWEENEY C S.Development of a real-time PCR assay for monitoring anaerobic fungal and cellulolytic bacterial populations within the rumen［J］.FEMSMicrobiology Ecology，2006，58(3):572－582.

［10］ MENKE K H，RAAB L，SALEWSKI A，et al.The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feedingstuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro［J］.The Journal of Agriculture Science，1979，93(1):217－222.

［11］ 張文舉，晏向華，龔月生，等.青貯對(duì)玉米秸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其瘤胃有效降解率的影響［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2003，23(1):8 －9.

［12］ 劉丹.化學(xué)處理對(duì)稻草超微結(jié)構(gòu)和瘤胃微生物活力的影響［D］.碩士學(xué)位論文.杭州:浙江大學(xué)，2004:15－16.

［13］范華，裴彩霞，董寬虎.不同保存方法對(duì)秸稈營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23(11):24 －28.

［14］ 華金玲.水稻秸青貯制作、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和利用效果的比較［D］.博士學(xué)位論文.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008:72－73.

［15］ BLüMMEL M，GIVENS D I，MOSS A R.Comparison of methane produced by straw fed sheep in opencircuit respiration with methane predicted by fermentation characteristics measured by an in vitro gas procedure［J］.Animal Feed Science and Technology，2005，123－124:379－390.

［16］ CAO Y，TAKAHASHI T，HORIGUCHI K-I，et al.Effect of adding lactic acid bacteria and molasses on fermentation quality and in vitro ruminal digestion of total mixed ration silage prepared with whole crop rice［J］.Japanese Society of Grassland Science，2010，56(1):19－25.

［17］ GETACHEW G，ROBINSON P H，DEPETERS E J，et al.Methane production from commercial dairy rations estimated using an in vitro gas technique［J］.Animal Feed Science and Technology，2005，123 －124:391－402.

［18］ 馮仰廉.反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2004.

［19］ 李炯明，莊蘇，王恬，等.海南霉素對(duì)人工瘤胃體外發(fā)酵調(diào)控的影響［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，28(1):41－46.

［20］ 李旺.瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的作用及影響因素［J］.中國(guó)畜牧雜志，2012，48(7):63 －66.

［21］ RUSSELL JB.The importance of pH in the regulation of ruminal acetate to propionate ratio and methane production in vitro［J］.Journal of Dairy Science，1998，81(12):3222－3230.

［22］ FERNANDO S C，PURVIS H T，NAJAR F Z，et al.Rumen microbial population dynamics during adaptation to a high-grain diet［J］.Applied and Environmental Microbiology，2010，76(22):7482 －7490.

［23］ 陳偉健，王翀，王佳堃，等.體外法研究氨化處理對(duì)稻草發(fā)酵特性及其微生物數(shù)量的影響［J］.中國(guó)奶牛，2011(14):11－14.

［24］ WANAPAT M，CHERDTHONG A.Use of Realtime PCR technique in studying rumen cellulolytic Bacteria population as affected by level of roughage in swamp buffalo［J］.Current Microbiology，2009，58(4):294－299.

［25］ 池振明.現(xiàn)代微生物生態(tài)學(xué)［M］.2版.北京:科學(xué)出版社，2010.

［26］ WOOD T M，WILSON C A，MCCRAE S I，et al.A highly active extracellular cellulase from the anaerobic rumen fungus Neocallimastix frontalis［J］.FEMS Microbiology Letter，1986，34(1):37 －40.

［27］ 郭嫣秋，胡偉蓮，劉建新.瘤胃甲烷菌及甲烷生成的調(diào)控［J］.微生物學(xué)報(bào)，2005，45(1):145 －148.

［28］ 郭嫣秋.瘤胃產(chǎn)甲烷菌定量檢測(cè)與微生物菌群調(diào)控研究［D］.博士學(xué)位論文.杭州:浙江大學(xué)，2008:119－120.

［29］ JOUANY J P，USHIDA K.The role of protozoa in feed digestion review［J］.Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，1999，12(1):113 －128.

［30］ 陳丹丹，刁其玉，姜成鋼，等.反芻動(dòng)物甲烷的產(chǎn)生機(jī)理和減排技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)，2012，32(4):66 －69.