抑癌基因Reprimo啟動子區(qū)甲基化在胃癌中表達(dá)及其臨床意義*

陜西省人民醫(yī)院腔鏡中心( 西安 710068)

李 穎 易 默▲ 何小勤▲

抑癌基因Reprimo啟動子區(qū)甲基化在胃癌中表達(dá)及其臨床意義*

陜西省人民醫(yī)院腔鏡中心( 西安 710068)

李 穎 易 默▲何小勤▲

目的:檢測胃癌中抑癌基因Reprimo啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及蛋白的表達(dá)，探討Reprimo啟動子區(qū)甲基化在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。方法:采用甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)及免疫組化(SP法)檢測慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生(36例)、異型增生(23例)、胃癌(42例)標(biāo)本中Reprimo基因啟動子區(qū)的甲基化及蛋白表達(dá)情況，并與正常胃粘膜組織(20例)作為對照進(jìn)行對比分析。結(jié)果：腸上皮化生、異型增生和胃癌中Reprimo基因啟動子區(qū)甲基化陽性率依次升高。正常對照組未檢出甲基化，與異型增生和胃癌相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Reprimo基因啟動子區(qū)甲基化在異型增生和胃癌中的陽性率顯著高于腸上皮化生組。Reprimo蛋白表達(dá)率依次降低且明顯低于正常對照組，啟動子區(qū)甲基化與蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論：在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中Reprimo基因啟動子區(qū)發(fā)生了甲基化，其高甲基化狀態(tài)影響了Reprimo蛋白的表達(dá)，可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，是胃癌發(fā)生的早期分子事件。

胃癌發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多因素參與的過程，研究胃癌發(fā)生過程中基因水平的改變，有助于探究癌變的機(jī)制及尋找胃癌早期診斷的分子標(biāo)志物。近來研究表明，抑癌基因啟動子區(qū)的高甲基化與基因表達(dá)缺失有關(guān)，可能是癌癥發(fā)生過程中的重要機(jī)制[1]。Reprimo基因是新近發(fā)現(xiàn)的潛在抑癌基因，位于人類染色體2q23上，是調(diào)控細(xì)胞正常生長的基因之一。其編碼的蛋白位于胞質(zhì)，是一種高度糖基化的蛋白。是P53介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控的下游信號，可使異常的細(xì)胞停滯在G2期，阻止細(xì)胞增殖。Reprimo啟動子異常甲基化可以抑制轉(zhuǎn)錄，引起G2/M檢查點調(diào)控發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[2]。本研究采用甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)MSP及免疫組化(SP法)檢測經(jīng)胃鏡獲取的病理證實的正常胃粘膜、慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生、異型增生和胃癌中Reprimo基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)情況，旨在了解抑癌基因Reprimo甲基化在胃癌發(fā)生、發(fā)展中可能的作用。

材料與方法

1 主要儀器及試劑 Gel Doc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；Gene Amp PCR System 9700PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品；甲基化修飾試劑盒以及PCR試劑均為美國Zymo Research 公司產(chǎn)品；全自動脫蠟抗原修復(fù)液為英國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；Reprimo抗體為英國Biorbyt公司產(chǎn)品；修復(fù)液為英國LabVision PT Module公司。

2 一般資料 選取2012年6月至2013年10月在陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)二科門診及住院接受診治的胃病患者101例，其中,男68例，女43例，年齡21～80歲，平均年齡(65．2±9．2)歲，所有患者均未接受放射、化學(xué)及免疫治療。收集以上病例標(biāo)本，將其分成兩份：①用10%中性甲醛固定，石蠟包埋；②在20 min內(nèi)保存于-80℃液氮中備用。經(jīng)我院病理科證實符合入組條件標(biāo)本按病理級別分為慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生36例，異型增生23例，胃癌42例，納入本研究。20例正常胃粘膜組織取自門診健康志愿者，本研究獲所有患者和健康志愿者知情同意。

3 方 法

3.1 甲基化特異性PCR 檢測Reprimo 基因啟動子區(qū)甲基化

3.1.1 組織DNA提取: 組織DNA提取嚴(yán)格按照QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN，德國)操作說明書進(jìn)行。核酸蛋白分析儀Nanodrop2000測其A值, A 260/280在1.8～2.0之間，符合純度要求，凝膠電泳檢測提取DNA的質(zhì)量, 剩余DNA置于-20 ℃凍存。

3.1.2 組織DNA修飾及甲基化特異性PCR(methylationspecific PCR): 取組織DNA 500 ng, 采用EZ DNA Methylation-GOLD Kit(D5005)試劑盒(美國Zymo Research)進(jìn)行DNA亞硫酸氫鹽修飾與純化,根據(jù)Zymo TaqTMPre Mix(ZYMO，美國)說明書進(jìn)行PCR反應(yīng), 引物設(shè)計根據(jù)在線軟件上完成，具體序列參見附表。由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s， 62℃退火，72℃延伸30 s， 共42個循環(huán)，72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物10 μl，3%瓊脂糖凝膠電泳。Sss．I甲基轉(zhuǎn)移酶(New England Biolabs，美國)修飾的正常人外周血淋巴細(xì)胞DNA作為甲基化陽性對照，以未經(jīng)修飾的正常人外周血淋巴細(xì)胞DNA作為非甲基化陽性對照，以雙蒸水代替模板作為空白對照。使用BIO-RAD凝膠成像儀分析成像結(jié)果。由成像儀自帶的軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行相對定量，計算甲基化程度。所有的甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后用ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems，美國)進(jìn)行測序分析。

附表 引物序列

MF：上游甲基化引物，MR：下游甲基化引物，UMF：上游非甲基化引物，UMR：下游非甲基化引物，M為甲基化，U為非甲基化。

3.2 免疫組織化學(xué)方法檢測Reprimo蛋白表達(dá):采取EnVision染色法檢測Reprimo基因編碼蛋白的表達(dá)，采用2μm厚切片，烤片1.5～2h；常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)PT Module修復(fù)，山羊血清封閉后依次滴加一抗4℃過夜，生物素化二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精襯染后封片。由兩位高年資病理醫(yī)師獨立閱片。用PBS代替一抗平行操作染色做陰性對照，用經(jīng)反復(fù)驗證的已知陽性片做陽性對照。以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為Reprimo基因陽性表達(dá)細(xì)胞，每張切片隨機(jī)觀察10個高倍視野(×400)，計數(shù)陽性細(xì)胞與總細(xì)胞的比值。陽性細(xì)胞<5%為陰性(-)，陽性細(xì)胞>5%為陽性(+)。

3.3 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS13．0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。各組病變中甲基化率及蛋白陽性表達(dá)率采用Fish確切概率或χ2檢驗； Reprimo基因甲基化與蛋白表達(dá)的關(guān)系采用Pearson列聯(lián)系數(shù)分析。P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Reprimo基因啟動子區(qū)甲基化檢測結(jié)果：腸上皮化生、異型增生和胃癌中Reprimo基因的甲基化率隨病理級別增高均呈遞增趨勢。腸上皮化生、異型增生和胃癌中Reprimo基因甲基化率依次為16.7% (6/36)、30.4%(8/23)和57.1%(24/42)； 20名正常對照均未檢出基因甲基化。異型增生和胃癌中Reprimo基因甲基化率高于正常對照(P<0．05)，異型增生中Reprimo基因的甲基化率和胃癌相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)。甲基化Reprimo基因MSP產(chǎn)物測序結(jié)果證實，甲基化的C由于甲基的“保護(hù)”而在亞硫酸氫鈉修飾后不變，而非甲基化的C則轉(zhuǎn)變?yōu)門。

(M:甲基化;U:非甲基化;Positive:陽性對照;Negative:陰性對照;H2O:蒸餾水對照;1:胃癌組織;2:異型增生;3:腸上皮化生)

圖1 甲基化特異PCR檢測不同組織中Reprimo結(jié)果

2 Reprimo蛋白表達(dá)情況及與基因甲基化的關(guān)系：101例患者中有61例表達(dá)Reprimo蛋白，其余40例判定為陰性，正常對照均為陽性表達(dá)(圖1)。61例表達(dá)陽性組織中僅12例(19.67%)發(fā)生Reprimo基因甲基化，而40例表達(dá)陰性組織中26例發(fā)生甲基化(65.0%)。Reprimo蛋白表達(dá)與基因甲基化顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.4576，P=0．000)。

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個連續(xù)性過程，其中“慢性胃炎-胃粘膜萎縮-腸上皮化生-異型增生-胃癌”的發(fā)病模式已得到認(rèn)可[3]。由于缺乏特殊典型癥狀大多數(shù)胃癌患者在確診時已處于中晚期，胃癌的早期診斷依賴于對癌前病變的隨訪與追蹤。

抑癌基因也稱為抗癌基因。生物體內(nèi)細(xì)胞在增值、分化和凋亡的過程中受到體內(nèi)正性和負(fù)性兩類調(diào)控信號的調(diào)節(jié)，正性信號促使細(xì)胞進(jìn)入增值周期，抑制分化；而負(fù)性信號則抑制細(xì)胞增值，并促進(jìn)其成熟分化。腫瘤的發(fā)生起源于細(xì)胞增值和分化調(diào)控失常，使細(xì)胞持續(xù)增值不能及時分化和凋亡。至今已發(fā)現(xiàn)10余種抑癌基因，Reprimo基因是新近發(fā)現(xiàn)的潛在抑癌基因。位于人類染色體2q23上，是調(diào)控細(xì)胞正常生長的基因之一。其編碼的蛋白定位于胞質(zhì)，是一種高度糖基化的蛋白。是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子P53介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控的下游信號，可使異常的細(xì)胞停滯在G2期，阻止細(xì)胞增殖。表觀遺傳是指DNA 序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變[4]。這種改變是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生的改變，即基因型未發(fā)生變化而表型卻發(fā)生了改變，且這種改變在發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞[5]。決定表觀遺傳學(xué)過程的主要因素為DNA 修飾、組蛋白修飾以及非編碼RNA 調(diào)控。表觀遺傳學(xué)研究包括染色質(zhì)重塑、DNA 甲基化、X 染色體失活、非編碼RNA 調(diào)控四個方面，任何一方面的異常都將影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)，導(dǎo)致復(fù)雜綜合征、多因素疾病以及癌癥。DNA 甲基化是最常見的復(fù)制后及轉(zhuǎn)錄前修飾方式之一，在基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)育調(diào)節(jié)、基因組印跡等方面發(fā)揮重要作用。近期研究表明抑癌基因啟動子區(qū)域CpG島(富含雙核苷酸“CG”的區(qū)域)高甲基化引起的表達(dá)沉默或下調(diào)被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的重要原因之一[6]。基因甲基化及其表達(dá)的缺失在腫瘤細(xì)胞中是一種常見的現(xiàn)象，可能是某些類型人類腫瘤的發(fā)生機(jī)制，這種思想指導(dǎo)許多學(xué)者單獨對某些腫瘤在診斷、治療與預(yù)后評估方面進(jìn)行該基因的研究。Gazdar[7]等發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中Reprimo基因失活，認(rèn)為DNA甲基化是其失活的主要機(jī)制，并且這種變化發(fā)生在腫瘤的早期階段。而Bernal[8]用甲基化特異性PCR方法檢測43例胃癌患者及31例健康人群胃粘膜組織及血漿樣本，發(fā)現(xiàn)在胃癌患者組織及血漿中，Reprimo基因甲基化的檢出率分別為97.7% (42 / 43) 和95.3% (41 /43)，而在對照人群中，檢測率則只有9.7%。Takahashi[2]等對645例腫瘤患者(代表16個腫瘤類型)進(jìn)行Reprimo基因異常甲基化情況檢測,Reprimo啟動子發(fā)生甲基化在胃癌癌患者中占79%。張瑜[9]等分析了Bernal和Takahashi等報道，認(rèn)為Reprimo基因異常甲基化在胃癌患者中具有特異性，可作為胃癌早期發(fā)現(xiàn)的重要指標(biāo)。

為驗證抑癌基因Reprimo甲基化與胃癌發(fā)生的關(guān)系，我們采用甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)及免疫組化(SP法)連續(xù)觀察從慢性胃炎-胃粘膜萎縮-腸上皮化生-異型增生-胃癌過程中抑癌基因Reprimo啟動子發(fā)生甲基化陽性率及其蛋白表達(dá)。在本實驗觀察到Reprimo基因甲基化率從腸上皮化生-異型增生-胃癌依次增加，分別是12.5 (9/36)、28.5%(8/28)和42.8%(18/42)。腸上皮化生中只有低水平的基因甲基化，與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而異型增生和胃癌中的甲基化率明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，異型增生和胃癌中甲基化率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由以上結(jié)果可推斷Reprimo基因高甲基化在胃粘膜病變由腸上皮化生過渡到異型增生時發(fā)生了質(zhì)的改變，可能是胃癌發(fā)生的早期分子事件。實驗發(fā)現(xiàn)Reprimo啟動子區(qū)甲基化與蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。從免疫組化的圖片中可以觀察到腸上皮化生-異型增生-胃癌發(fā)展過程中細(xì)胞從陽性率高的黃染逐漸到陰性率高的淡藍(lán)色變化過程。

綜上所述，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中Reprimo基因啟動子區(qū)發(fā)生了甲基化，并在異性增生階段發(fā)生了重要的變化，可能是胃癌發(fā)生的早期分子事件，為尋找胃癌早期診斷的分子標(biāo)志物提供一定的理論依據(jù)。由于標(biāo)本收集及實驗條件的限制本實驗對異型增生未能再進(jìn)一步分組為輕度及中重度，對于胃癌標(biāo)本未能進(jìn)一步劃分為早期及中晚期進(jìn)行觀察，對胃癌的演變過程中可能存在一定缺失，期待延長標(biāo)本收集時間，擴(kuò)大實驗標(biāo)本數(shù)量，更進(jìn)一步的深入研究。

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(收稿：2014-11-25)

*陜西省科技廳社會發(fā)展攻關(guān)項目資助(2013K12-03-18)

胃腫瘤/免疫學(xué) 轉(zhuǎn)錄啟動子 @Reprimo基因 @ 甲基化 抑制蛋白類

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.004

▲陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)二科