模擬腸道環(huán)境下腸道益生菌對(duì)三種重金屬離子的富集作用的研究

張 何,羅程印,傅 昕

(湖南工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,湖南湘潭 411104)

模擬腸道環(huán)境下腸道益生菌對(duì)三種重金屬離子的富集作用的研究

張 何,羅程印,傅 昕

(湖南工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,湖南湘潭 411104)

本研究考察了嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌三種腸道益生菌在模擬腸道環(huán)境條件下生長情況及對(duì)Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性。結(jié)果顯示:嗜酸乳桿菌對(duì)Cr6+有較強(qiáng)的吸附和富集作用,最大吸附率為70%,吸附量為0.0021 mg/g;嗜熱鏈球菌對(duì)Cr6+、Cd2+均有較強(qiáng)的吸附和富集作用,最大吸附率分別為50%和62%,吸附量分別為0.0015 mg/g和0.1057 mg/g;雙歧桿菌對(duì)Cr6+、Cd2+均有較強(qiáng)的吸附和富集作用,最大吸附率分別為66.6%和69.9%,吸附量分別為0.0019 mg/g和0.1298 mg/g;三種腸道益生菌在模擬腸道環(huán)境下對(duì)Pb2+均無明顯吸附作用。

腸道益生菌,腸道環(huán)境,重金屬離子,富集

隨著人類對(duì)重金屬的開采、冶煉、加工以及工業(yè)廢水的不當(dāng)排放,造成大量重金屬如鉛、汞、鎘、鉻等進(jìn)入大氣、水、土壤中,造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。近年來,食品安全事件也頻頻發(fā)生[1-3]。在對(duì)重金屬處理的方法中,生物處理技術(shù)已被證明比傳統(tǒng)的化學(xué)沉淀法、離子交換法、活性炭吸附法等更為優(yōu)越,而生物處理法中目前應(yīng)用最多的是生物吸附法[4-5]。當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的通?？梢晕街亟饘匐x子的微生物種類較多[6-9],主要是由細(xì)菌[10]、真菌[11]和藻類[12]組成。

益生菌(Probiotics)是一種通過改善宿主腸道微生物平衡而發(fā)揮作用的活性微生物,具有廣泛的生理功效,能夠?yàn)槿梭w營養(yǎng)和健康提供良好的保障[13-19]。由于益生菌對(duì)人體有著極其重要的保健功能,已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域,如活性益生菌乳飲料、酸奶等。然而,腸道益生菌對(duì)于腸道中重金屬的吸附及轉(zhuǎn)化性能研究還未見報(bào)道。

環(huán)境中污染物對(duì)人體的生物有效性胃腸體外實(shí)驗(yàn)始于營養(yǎng)學(xué)研究食物中鐵元素對(duì)人體的生物有效性[20]。MRS培養(yǎng)基是一種用于模擬體外胃腸道環(huán)境的常用細(xì)菌培養(yǎng)基[21-22],而對(duì)于重金屬離子的體外腸道模擬分析,由于pH對(duì)其溶解析出有較大的影響,腸道模擬方法中的pH一般控制在5.5～7.5左右[23]。本研究考察了三種腸道益生菌(雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌)在模擬腸道環(huán)境條件下對(duì)重金屬(鉻、鎘、鉛)的吸附性能,探索其減弱重金屬危害的有益性,可更加全面的認(rèn)識(shí)腸道益生菌的健康維護(hù)作用,能夠?yàn)橐嫔谑称分械倪M(jìn)一步應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三種腸道益生菌(嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus),嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus),雙歧桿菌(Bifidobacterium) 北京豫鼎鑫捷科技有限公司;酵母膏、蛋白胨 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;吐溫80、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、牛肉膏、硫酸鎂、硫酸錳、葡萄糖、六次甲基四胺、重鉻酸鉀、二甲酚橙、孔雀綠、鄰苯二甲酸氫鉀、硝酸鎘、硝酸鉛 生工生物工程上海(股份)有限公司;二苯碳酰二肼 上?？婆d商貿(mào)有限公司;所用試劑均為分析純,使用前未進(jìn)一步純化,實(shí)驗(yàn)用水為電阻率大于18 MΩ·cm 的超純水。

電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器公司;TDL-40B型離心機(jī)、DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上?；|實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司;UV-1800 型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司;超純水器 重慶力德高端水處理設(shè)備;厭氧培養(yǎng)罐 瑞世康科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 益生菌的培養(yǎng) 為了考察模擬腸道環(huán)境下益生菌對(duì)金屬離子的富集作用,采用MRS為細(xì)菌培養(yǎng)基,溫度控制在37 ℃左右,pH為6.8。采用的MRS培養(yǎng)基成分為:酵母膏5.0 g;吐溫80 1.0 mL;乙酸鈉5.0 g;磷酸氫二鉀2.0 g;檸檬酸氫二銨2.0 g;牛肉膏10 g;硫酸鎂0.58 g;硫酸錳0.189 g;葡萄糖20.0 g;蛋白胨10 g;蒸餾水1000 mL,pH調(diào)節(jié)至6.8,在121 ℃蒸汽滅菌30 min。將實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種劃線接種到MRS固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24～32 h,長出單菌落后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,確定為純種,再將純菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增。接種后,于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng),而由于雙歧桿菌需要在厭氧靜置條件下培養(yǎng),但為了增加傳值,每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶2～3次。

1.2.2 三種重金屬標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

1.2.2.1 六價(jià)鉻(K2Cr2O7)標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別準(zhǔn)確移取0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 mL的鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液(1×10-5mol/L)于7個(gè)50 mL容量瓶中,再向每個(gè)50 mL容量瓶中加入0.5 mL未加鉻離子的空白MRS培養(yǎng)液,依次加入0.6 mL(1+1)H2SO4(1體積濃硫酸加1體積蒸餾水等體積混合)和1.0 mL二苯碳酰二肼溶液,立即混勻,用蒸餾水定容到刻度,再靜置反應(yīng)5 min后,以不加Cr6+溶液為參比,在540 nm波長測(cè)定其吸光度,然后繪制吸光度與鉻離子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線[24]。

1.2.2.2 二價(jià)鎘(Cd(NO3)2)標(biāo)準(zhǔn)曲線 將0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL的10 mg/L的鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到50 mL的容量瓶中,然后加入0.5 mL 未加鎘離子的空白MRS培養(yǎng)液,再分別加入5 mL六次甲基四胺-KNO3-HNO3緩沖溶液(pH6.3),4.0 mL的0.1%二甲酚橙水溶液,再用蒸餾水定容到刻度,搖勻靜置20 min,于室溫25 ℃時(shí),以不加Cd2+溶液為參比,在波長為578.4 nm處測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[25]。

1.2.2.3 二價(jià)鉛(Pb(NO3)2)標(biāo)準(zhǔn)曲線 將0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL的100 mg/L的鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液依次加入到50 mL的容量瓶中,分別加入0.5 mL未加鉛離子的空白MRS培養(yǎng)液,然后分別加入2 mL 0.05% 孔雀綠,2 mL pH4.0的Clark-Lubs緩沖溶液,10 mL KI(10%),用蒸餾水定容至刻度,靜置反應(yīng)10 min,以不加Pb2+溶液為參比,在波長為700 nm處測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[26]。

1.2.3 三種腸道益生菌對(duì)三種重金屬的吸附特性測(cè)定 三種腸道益生菌分別在加入一定濃度重金屬離子(六價(jià)鉻(0.05 mg/L)、二價(jià)鎘(0.3 mg/L)、二價(jià)鉛(2 mg/L))的模擬腸道環(huán)境的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng),平行三次。在無菌操作下每隔4 h移取5 mL腸道益生菌(雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌)MRS培養(yǎng)液于離心管中,在4000 r/min下離心10 min后,移取0.5 mL上清培養(yǎng)液于50 mL容量瓶中待測(cè),另取一50 mL容量瓶加入0.5 mL MRS培養(yǎng)液(未加重金屬離子)作為對(duì)照,依次加入相應(yīng)的反應(yīng)試劑(所加試劑與標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定試劑一致),立即搖勻,用蒸餾水定容至刻度。反應(yīng)完成后,在相應(yīng)波長下測(cè)定其吸光度,然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出溶液中重金屬離子的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1 Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三種重金屬離子的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Cr6+(a), Cd2+(b)and Pb2+(c)determination

2.2 嗜酸乳桿菌對(duì)Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性分析

微生物對(duì)重金屬的吸附作用機(jī)理為:重金屬對(duì)微生物的生長代謝過程有著非常重要的作用,比如Zn、Ni、Cr等在微生物的生化反應(yīng)過程中起著催化劑的作用,可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁以及可以維持滲透壓的平衡;而Ag、Cd、Hg、Pb等非必需元素則可以取代結(jié)合位點(diǎn)的必需元素,能夠與配基反應(yīng),從而達(dá)到吸附及富集的作用[27]。

嗜酸乳桿菌是一類存在于胃和小腸內(nèi)具有調(diào)整腸道菌群平衡、抑制腸道不良微生物的增殖益生菌?？疾炝耸人崛闂U菌在模擬腸道環(huán)境的培養(yǎng)過程中對(duì)三種重金屬離子的吸附特性。從圖2曲線a可看出,嗜酸乳桿菌對(duì)Cr6+的吸附一直到培養(yǎng)12 h時(shí)仍不明顯,但在12 h培養(yǎng)后,對(duì)Cr6+的吸附能力迅速上升,在培養(yǎng)36 h時(shí)吸附率達(dá)到最大,吸附率可達(dá)初始濃度的70%,吸附量為0.0021 mg/g。然而,在培養(yǎng)36 h后,嗜酸乳桿菌對(duì)Cr6+的吸附率逐漸下降,可能由于菌齡的增加、菌體老化、活力降低等因素導(dǎo)致嗜酸乳桿菌對(duì)Cr6+的吸附能力下降,在培養(yǎng)48 h時(shí)其吸附率降低到初始濃度的36%。由此可以說明嗜酸乳桿菌對(duì)Cr6+有較強(qiáng)的吸附和富集作用。從圖2曲線b可看出嗜酸乳桿菌直到培養(yǎng)12 h后,對(duì)Cd2+的吸附能力才開始逐漸增強(qiáng),吸附率達(dá)到初始濃度的14.3%,在培養(yǎng)36 h時(shí)吸附率達(dá)到最大,僅為初始濃度的20.6%,由此說明嗜酸乳桿菌對(duì)Cd2+有較弱的吸附和富集作用。從圖2曲線c可看出,嗜酸乳桿菌對(duì)Pb2+未有明顯的吸附和富集作用?？傊?根據(jù)圖2可以知道,嗜酸乳桿菌只對(duì)Cr6+有較強(qiáng)的吸附特性,同時(shí)這種吸附性在一定程度上受到環(huán)境的影響(如菌齡、pH等),而對(duì)Cd2+只有較弱的吸附能力。

圖2 嗜酸乳桿菌對(duì)Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三種重金屬離子的吸附特性Fig.2 Adsorption characteristics of Cr6+(a),Cd2+(b) and Pb2+(c)by Lactobacillus acidophilus

2.3 嗜熱鏈球菌對(duì)Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性分析

嗜熱鏈球菌被認(rèn)為是“公認(rèn)安全性(GRAS)”成分,廣泛用于生產(chǎn)一些重要的發(fā)酵乳制品,包括酸奶和奶酪,且對(duì)人體具有多種保健作用,如抗癌、調(diào)節(jié)血壓、延緩衰老等。

考察了嗜熱鏈球菌在模擬腸道環(huán)境的培養(yǎng)過程中對(duì)三種重金屬離子的吸附特性。從圖3曲線a可看出,在嗜熱鏈球菌的培養(yǎng)過程中,對(duì)Cr6+的吸附在培養(yǎng)16 h前未有明顯變化,但在培養(yǎng)16 h后對(duì)Cr6+的吸附率迅速上升,在24 h時(shí)吸附率達(dá)到最大,吸附率達(dá)到初始濃度的50%,吸附量為0.0015 mg/g,但在培養(yǎng)24 h后可能由于菌齡等因素的影響,嗜熱鏈球菌對(duì)Cr6+的吸附能力下降,在培養(yǎng)40 h時(shí)其吸附率降低到初始濃度的38.6%。從圖3曲線b可看出,嗜熱鏈球菌對(duì)Cd2+也具有較強(qiáng)的吸附和富集作用,培養(yǎng)12 h后吸附能力開始加強(qiáng),在24 h時(shí)達(dá)到最大,吸附率達(dá)到初始濃度的62%,吸附量為0.1057 mg/g。其后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,嗜熱鏈球菌對(duì)Cd2+的吸附能力開始下降,在培養(yǎng)40 h時(shí)其吸附率降低到初始濃度的39.3%。從圖3曲線c可看出,嗜熱鏈球菌對(duì)Pb2+未有明顯的吸附和富集作用?？傊?根據(jù)圖3可以知道,嗜熱鏈球菌對(duì)Cr6+、Cd2+都有較強(qiáng)的吸附特性,但這種吸附性在一定程度上也受到環(huán)境的影響(如菌齡、pH等)。

圖3 嗜熱鏈球菌對(duì)Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三種重金屬離子的吸附特性Fig.3 Adsorption characteristics of Cr6+(a),Cd2+(b) and Pb2+(c) by Streptococcus thermophilus

2.4 雙歧桿菌對(duì)Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性分析

雙歧桿菌是人體腸道中的一種重要的益生菌,因其末端常常分叉而得名,其保健作用包括:腫瘤防治、保護(hù)肝臟、防治心血管疾病等?？疾炝穗p歧桿菌在模擬腸道環(huán)境的培養(yǎng)過程中對(duì)三種重金屬離子的吸附特性。從圖4曲線a可看出,培養(yǎng)12 h前雙歧桿菌對(duì)Cr6+的吸附較少,但培養(yǎng)12 h后對(duì)Cr6+的吸附率快速上升,32 h時(shí)吸附率達(dá)到最大,可達(dá)初始濃度的66.6%,吸附量為0.0019 mg/g。在培養(yǎng)32 h后雙歧桿菌對(duì)Cr6+的吸附率開始下降,表明雙歧桿菌對(duì)Cr6+的吸附能力下降,在培養(yǎng)40 h時(shí)其吸附率降低到初始濃度的25.9%,由此可見嗜熱鏈球菌對(duì)Cr6+有較強(qiáng)的吸附和富集作用。從圖4曲線b可看出,雙歧桿菌對(duì)Cd2+也具有較強(qiáng)的吸附和富集作用,培養(yǎng)8 h后吸附開始加強(qiáng),在20 h時(shí)達(dá)到最大,可達(dá)初始濃度的69.9%,吸附量0.1298 mg/g。在隨后的培養(yǎng)中雙歧桿菌對(duì)Cd2+的吸附性能保持穩(wěn)定,并不隨著菌齡的增加而降低,在培養(yǎng)40 h時(shí)其吸附量仍可達(dá)到初始濃度的67.9%。從圖4曲線c可看出,雙歧桿菌對(duì)Pb2+沒有明顯的吸附和富集作用?？傊?根據(jù)圖4可以知道,雙歧桿菌對(duì)Cr6+、Cd2+都有很強(qiáng)的吸附特性。然而,雙歧桿菌對(duì)Cd2+的吸附并沒有受到培養(yǎng)環(huán)境的影響,在培養(yǎng)40 h時(shí)仍可達(dá)到67.9%,這說明雙歧桿菌與Cd2+的吸附方式更加穩(wěn)定。

圖4 雙歧桿菌對(duì)Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三種重金屬離子的吸附特性Fig.4 Adsorption characteristics of Cr6+(a),Cd2+(b) and Pb2+(c) by Bifidobacterium

3 結(jié)論

通過對(duì)嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌培養(yǎng)液中Cr6+、Cd2+、Pb2+的測(cè)定,可以發(fā)現(xiàn):嗜酸乳桿菌對(duì)Cr6+有較強(qiáng)的吸附和富集作用,在培養(yǎng)12 h時(shí)吸附率開始上升,36 h達(dá)到最大,隨后由于菌齡老化等因素,吸附率開始下降;嗜熱鏈球菌對(duì)Cr6+、Cd2+均有較強(qiáng)的吸附和富集作用,在培養(yǎng)16 h時(shí)對(duì)Cr6+吸附率開始上升,36 h達(dá)到最大,而對(duì)于Cd2+的吸附率是在培養(yǎng)12 h時(shí)開始上升,24 h達(dá)到最大,隨后嗜熱鏈球菌對(duì)這兩種離子的吸附率都開始下降;雙歧桿菌對(duì)Cr6+、Cd2+也有一定的富集作用,對(duì)Cr6+的吸附率是在培養(yǎng)12 h后開始上升,32 h時(shí)達(dá)到最大,隨后吸附率開始隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸下降,而對(duì)Cd2+的富集顯得更加明顯,在培養(yǎng)8 h后吸附率開始上升,20 h時(shí)達(dá)到最大,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,雙歧桿菌對(duì)Cd2+的吸附能力并不降低,根據(jù)“吸附+細(xì)胞膜傳輸”模型,可能是生長的雙歧桿菌對(duì)Cd2+具有胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)哪芰?嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌在模擬腸道環(huán)境下對(duì)Pb2+均無明顯富集作用。該研究的完成進(jìn)一步了解了腸道益生菌的保健作用,證明了腸道益生菌可通過吸附或胞內(nèi)運(yùn)輸作用減輕腸道對(duì)重金屬的吸收,可為其在食品中的進(jìn)一步應(yīng)用提供支持。

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Study on the enrichment of intestinal probiotics to three heavy metal ions under simulated intestinal environment

ZHANG He,LUO Cheng-yin,FU Xin

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan Institute of Engineering,Xiangtan 411104,China)

In this paper,the absorption characteristics ofLactobacillusacidophilus,StreptococcusthermophilusandBifidobacteriumto Cr6+、Cd2+、Pb2+under the simulated intestine environment were studied. The results indicated theLactobacillusacidophilushad strong adsorption and enrichment to Cr6+,and the adsorption ratio was 70% and the adsorption amount was 0.0021 mg/g.Streptococcusthermophilusalso had strong adsorption and enrichment to Cr6+and Cd2+,and the adsorption ratio was 50% and 62%,and the adsorption amount was 0.0015 mg/g and 0.1057 mg/g,respectively.Bifidobacteriumalso had strong adsorption and enrichment to Cr6+and Cd2+,and the adsorption ratio was 66.6% and 69.9%,and the adsorption amount was 0.0019 mg/g and 0.1298 mg/g,respectively. There was no obvious adsorption of Pb2+among the three kinds of intestinal probitics under simulated intestinal environment.

intestinal probiotics;intestinal environment;heavy metal ions;enrichment

2015-01-23

張何(1977-),男,博士,副教授,研究方向:生物分析化學(xué),E-mail:mzhang_he@126.com。

湖南省自然科學(xué)基金(2015JJ2039,14JJ3133);湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金(12B029);湖南工程學(xué)院博士啟動(dòng)基金。

TS201.4

A

1002-0306(2015)21-0349-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.064