六堡茶提取物對(duì)高脂小鼠腸道菌群的影響研究

趙園園,黃 麗,韋保耀,滕建文,夏 寧

(廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

六堡茶提取物對(duì)高脂小鼠腸道菌群的影響研究

趙園園,黃 麗,韋保耀*,滕建文,夏 寧

(廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

將六堡茶提取物與高脂小鼠糞便進(jìn)行體外發(fā)酵培養(yǎng),比較正常對(duì)照組和體外發(fā)酵組的菌群變化情況,探討六堡茶對(duì)高脂小鼠腸道菌群的影響。結(jié)果顯示,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,總厭氧菌的數(shù)量與發(fā)酵0 h比較呈現(xiàn)顯著增長趨勢(shì),且在發(fā)酵至24 h,總厭氧菌的數(shù)量明顯超過了正常對(duì)照組,而總需氧菌數(shù)量在發(fā)酵36 h后,才發(fā)生顯著性變化,較0 h明顯降低了8.4%,并顯著低于正常對(duì)照組水平。其中,雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌和腸球菌的數(shù)量在發(fā)酵36 h后,與正常對(duì)照組相比無顯著性差異,均趨向于正常對(duì)照組水平,而大腸桿菌的數(shù)量雖呈降低趨勢(shì),但仍高于正常對(duì)照組。研究結(jié)果表明,六堡茶提取物能夠促進(jìn)高脂小鼠腸道菌群中厭氧菌的生長,并抑制需氧菌的繁殖,調(diào)節(jié)高脂飲食引起的小鼠腸道菌群紊亂。

六堡茶提取物,體外發(fā)酵,腸道菌群,高脂血癥

人體腸道內(nèi)微生物種類繁多,這些菌群與宿主的健康息息相關(guān)[1]。越來越多的研究表明,腸道菌群與血脂之間有千絲萬縷的聯(lián)系,高脂血癥能夠影響腸道菌群的結(jié)構(gòu),使腸道正常菌群系統(tǒng)紊亂,雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌數(shù)量降低[2-3]。

研究證明茶葉具有改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、輔助降血脂的功效。然而研究發(fā)現(xiàn),隨著茶的攝入,其功能性物質(zhì)在胃腸道較穩(wěn)定,大約有90%～95%的成分未被小腸吸收,而是進(jìn)入結(jié)腸,經(jīng)過腸道微生物代謝后被吸收入血,進(jìn)而發(fā)揮作用[4]。吳香蘭[5]、金莉莎[6]的研究表明茶葉對(duì)常見致病菌和腸道有害菌的抑制效果明顯,并且能夠有效調(diào)節(jié)腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量,具有恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡的作用。Tzounis等人通過體外發(fā)酵模型對(duì)多酚單體對(duì)腸道菌群的影響進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)加入兒茶素后雙歧桿菌的數(shù)量顯著增加,而大腸桿菌和梭菌屬被抑制[7]。這些研究均表明茶葉的功能性組分能夠調(diào)節(jié)腸道菌群,但未能與某些疾病引起的腸道菌群變化聯(lián)系起來,對(duì)茶葉如何通過腸道菌群發(fā)揮其生理功能的研究尚不多見,因此對(duì)于茶葉的保健功能作用機(jī)制闡述不夠全面。

表1 腸道菌群計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件

六堡茶屬黑茶類,因其獨(dú)特的品質(zhì),成為廣西梧州地理標(biāo)志產(chǎn)品。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明,六堡茶具有降血脂的功效[8],但其作用機(jī)理還未見報(bào)道;因此本研究通過體外培養(yǎng)的方法將六堡茶提取物與小鼠糞便進(jìn)行體外發(fā)酵,對(duì)發(fā)酵后的腸道菌群的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,研究六堡茶提取物對(duì)高脂小鼠的腸道菌群的調(diào)整作用,為探討六堡茶的降血脂機(jī)理提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六堡茶 梧州中茶茶廠,產(chǎn)品批號(hào)為:6918；實(shí)驗(yàn)小鼠 選擇日齡相同的SPF級(jí)昆明種健康小鼠,雌雄各半,體重為(20±2)g，廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn),許可證號(hào)為SCXK桂2009-0002；基礎(chǔ)飼料與高脂飼料 廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；血清總膽固醇(TC)檢測試劑盒(批號(hào):140104)、血清甘油三酯(TG)檢測試劑盒(批號(hào):140301)、血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測試劑盒(批號(hào):140407) 長春匯力生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YFD-2000型真空冷凍干燥機(jī) 西安德派生物科技公司；YQX-Ⅲ型厭氧培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；722型可見分光光度計(jì) 上海分析儀器三廠，HF-800A型半自動(dòng)化生化分析儀 上海舒康儀器技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 六堡茶提取物的制備 稱取粉碎后的茶葉10 g,加入70%乙醇在80 ℃下水浴回流浸提3次(固液比分別為1∶10、1∶8和1∶6),合并浸提液,離心,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后收集濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),凍干得六堡茶提取物3.18 g,其茶多酚含量占凍干物質(zhì)含量的10.3%。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠造模和糞便的采集 將20只小鼠編號(hào),隨機(jī)分為2組,各10只,一組為正常對(duì)照組,一組為高脂模型組。兩組均給予基礎(chǔ)飼料,適應(yīng)性喂養(yǎng)6 d,取尾血,測定TC、TG、HDL-C水平。比較正常對(duì)照組和高脂模型組TC、TG、HDL-C差異均無顯著性后,正常組給予基礎(chǔ)飼料,高脂組給予高脂飼料,喂養(yǎng)30 d后,取尾血,測定TC、TG、HDL-C水平。糞便采集:造模成功后,分別采集正常組和高脂組小鼠的糞便于無菌EP管中,低溫保存,用于后續(xù)分析。

1.2.3 體外發(fā)酵方法 參考文獻(xiàn)[9],取高脂小鼠糞便1 g,加入到4 mL已滅菌的生理鹽水中,在渦旋混合器上混合均勻,過濾。取1 mL濾液與10 mL厭氧培養(yǎng)液混合,制成腸菌培養(yǎng)液,在腸菌培養(yǎng)液中加入10 mg六堡茶提取物,混合均勻,在37 ℃下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)0、6、12、24、36 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,以上操作均在無菌環(huán)境下進(jìn)行。

1.3 分析方法

1.3.1 血脂水平測定 利用自動(dòng)化生化分析儀和分光光度計(jì),按測定試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測。

1.3.2 茶多酚含量的測定 參考文獻(xiàn)[10],測定茶多酚的含量,稱取0.1 g凍干樣品,用蒸餾水溶解,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用水定容至刻度,搖勻,待測。

沒食子酸工作液的制備:稱取0.110 g±0.001 g沒食子酸,于100 mL容量瓶中溶解并定容至刻度,搖勻。用移液管分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的上述溶液于100 mL容量瓶中,分別用蒸餾水定容至刻度,搖勻,濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL。

測定:用移液管分別移取沒食子酸工作液、水(空白對(duì)照)及測試液各1.0 mL于刻度試管內(nèi),在每個(gè)試管內(nèi)分別加入5.0 mL的福林酚試劑,搖勻。反應(yīng)3～8 min內(nèi),加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液,加水定容至刻度、搖勻。室溫下放置60 min,用10 mm比色皿,在765 nm波長條件下用分光光度計(jì)測定吸光度。

1.3.3 微生物的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

1.3.3.1 正常對(duì)照組小鼠糞便菌群培養(yǎng) 按照1.2.3所述,將正常對(duì)照組小鼠糞便制成腸菌培養(yǎng)液后,取1 mL培養(yǎng)液,用滅菌生理鹽水遞10倍稀釋,涂布,培養(yǎng),平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。培養(yǎng)條件見表1。

1.3.3.2 發(fā)酵組小鼠糞便菌群培養(yǎng) 分別在培養(yǎng)0、6、12、24、36 h后取1 mL培養(yǎng)液,如1.3.3.1所述操作,平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠高脂血癥模型的建立

具體結(jié)果見表2。

表2 正常對(duì)照組與高脂組小鼠血脂水平含量的變化±S,mmol/L)

注:**表示與正常對(duì)照組比較血脂水平差異極顯著p<0.01。

表3 小鼠糞便菌群計(jì)數(shù)結(jié)果

注:**表示與正常對(duì)照組比較,差異性極顯著(p<0.01);##表示與發(fā)酵0 h比較差異性極顯著(p<0.01)。

從表2可以看出,適應(yīng)期時(shí),高脂模型組小鼠血脂水平與正常對(duì)照組比較,無顯著性差異。造模30 d后,高脂組小鼠的血清TG和TC含量分別為3.72 mmol/L和7.11 mmol/L,HDL-C為0.54 mmol/L,高脂組與正常對(duì)照組比較,TG和TC的含量顯著性升高,而HDL-C含量顯著性降低(p<0.01)。與國家食藥總局頒布的評(píng)價(jià)方法[12]中描述一致。因此結(jié)果表明高脂血癥模型建立成功。

2.2 六堡茶對(duì)高脂血癥小鼠腸道菌群的影響

菌群計(jì)數(shù)結(jié)果如表3所示。

圖1 發(fā)酵不同時(shí)間各菌群數(shù)量相對(duì)于正常對(duì)照組菌群變化情況Fig.1 Changes of the number of bacterium of fermentation different time relative to normal control group注:SA=(QA-QA0)/QA0×100%;SZ=(QA-QZ)/QZ×100%。SA:發(fā)酵不同時(shí)間各菌群數(shù)相對(duì)于發(fā)酵0 h菌群數(shù)的變化率;QA:發(fā)酵不同時(shí)間各菌群數(shù)量;QA0:發(fā)酵0 h菌群數(shù)量;SZ:發(fā)酵不同時(shí)間各菌群數(shù)相對(duì)于正常對(duì)照組菌群數(shù)的變化率;QZ:正常對(duì)照組菌群數(shù)量。

2.2.1 高脂小鼠腸道菌群失調(diào)驗(yàn)證 由圖1可以看出,發(fā)酵0 h的總厭氧菌、雙歧桿菌、乳酸菌、擬桿菌和腸球菌的數(shù)量與正常對(duì)照組比較,分別降低了24.7%、9.6%、14.5%、10.9%、8.9%,而需氧菌和大腸桿菌的數(shù)量與正常對(duì)照組比較分別升高了6.2%、17%,與正常對(duì)照組差異性顯著。已有研究證明,高脂血癥可引起小鼠腸道菌群系統(tǒng)發(fā)生紊亂[2-3,13],因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合這一結(jié)論。

圖2 發(fā)酵不同時(shí)間各菌群數(shù)量相對(duì)于發(fā)酵0 h菌群變化情況Fig.2 Changes of the number of bacterium of fermentation different time relative to fermentation 0h group

2.2.2 六堡茶提取物對(duì)高脂小鼠腸道菌群數(shù)量的影響 由圖2可見,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,總厭氧菌的數(shù)量與發(fā)酵0 h比較呈現(xiàn)顯著增長趨勢(shì),且在發(fā)酵至24 h,總厭氧菌的數(shù)量明顯超過了正常對(duì)照組(圖1),而總需氧菌數(shù)量在發(fā)酵36 h后,才發(fā)生顯著性變化,較0 h明顯降低了8.4%,并顯著低于正常對(duì)照組水平(圖1)。結(jié)果表明,六堡茶提取物能促進(jìn)高脂小鼠糞便菌群中厭氧菌的生長,并抑制需氧菌的繁殖,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,總需氧菌和總厭氧菌數(shù)量逐漸趨向于正常小鼠的腸道菌群數(shù)量。

雙歧桿菌的變化情況:由圖2可知,六堡茶提取物與高脂小鼠糞便進(jìn)行發(fā)酵至6 h與12 h時(shí),雙歧桿菌數(shù)量變化不明顯,發(fā)酵至24 h后,雙歧桿菌數(shù)量較0 h明顯增加了4.1%,繼續(xù)發(fā)酵至36 h后,雙歧桿菌數(shù)量較0 h顯著增加了10.4%,但仍高于正常對(duì)照組水平。

乳酸桿菌的變化情況:由圖2可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,乳酸桿菌的數(shù)量呈顯著增加趨勢(shì),發(fā)酵至36 h,乳酸桿菌的數(shù)量與正常對(duì)照組相比無顯著性差異(圖1),由此可見,發(fā)酵至36 h后,乳酸桿菌的數(shù)量趨向于正常對(duì)照組水平。

擬桿菌的變化情況:由圖2可知,發(fā)酵6 h與24 h,擬桿菌的數(shù)量變化不明顯,發(fā)酵至24 h后,擬桿菌數(shù)量顯著增加,較0 h明顯增加了9.2%,繼續(xù)發(fā)酵至36 h,擬桿菌數(shù)量較0 h顯著增加了10.9%,且在發(fā)酵24 h,擬桿菌的數(shù)量與正常對(duì)照組相比無顯著性差異(圖1),由此可見,發(fā)酵至24 h,擬桿菌的數(shù)量趨向于正常對(duì)照組水平。

腸球菌的變化情況:由圖2可知,腸球菌數(shù)量的變化情況與擬桿菌相似,呈逐漸增加趨勢(shì),發(fā)酵至36 h,腸球菌的數(shù)量與正常對(duì)照組相比無顯著性差異(圖1)。

大腸桿菌的變化情況:由圖2可知,發(fā)酵至24 h,大腸桿菌的數(shù)量與0 h相比明顯降低了3.1%,繼續(xù)發(fā)酵至36 h,大腸桿菌的數(shù)量較0 h顯著降低了10.9%,但仍高于正常對(duì)照組水平(圖1)。

結(jié)果表明,六堡茶提取物能夠促進(jìn)高脂小鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌和腸球菌的生長,并在一定程度上抑制大腸桿菌的生長繁殖。

3 結(jié)論與討論

正常人體腸道中的細(xì)菌約400～500種,主要有擬桿菌屬、乳桿菌屬、梭菌屬、大腸埃希菌屬和雙歧桿菌屬等,其中約99%為厭氧菌。有研究表明,高脂飲食可使大鼠腸道乳酸菌和雙歧桿菌明顯降低[13]。豐富的碳水化合物及膳食纖維能夠促進(jìn)腸道厭氧菌的生長,而由于高脂飲食中脂類成分較多,使大腸菌群的養(yǎng)料來源減少,導(dǎo)致大腸桿菌等有害菌群快速生長,可能成為大腸菌群失衡的原因。而腸道菌群失調(diào)同時(shí)也會(huì)加重脂質(zhì)代謝紊亂。研究發(fā)現(xiàn),雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、擬桿菌中均可產(chǎn)生膽汁酸水解酶(BSH酶),此酶可把結(jié)合膽汁酸轉(zhuǎn)變成游離膽汁酸,影響膽汁酸的腸肝循環(huán),促使肝臟利用膽固醇合成膽汁酸增加,使血中的膽固醇更多的被轉(zhuǎn)化,實(shí)現(xiàn)降低血膽固醇的作用[14-20]。雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌和擬桿菌普遍存在于腸道中,其數(shù)量的減少可以削弱血中膽固醇被轉(zhuǎn)化利用的過程,使血脂升高。

茶葉具有改善腸道菌群結(jié)構(gòu)功效,其功能已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)同。吳香蘭以茯磚茶、青磚茶、千兩茶和六堡茶四種具有代表性的黑茶為研究對(duì)象,研究其抑菌效果和對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,研究表明四種茶葉對(duì)常見致病菌和腸道有害菌的抑制效果明顯,而對(duì)腸道有益菌群雙歧桿菌和乳酸菌的生長具有促進(jìn)作用,且六堡茶抑菌效果相對(duì)較好[5]。茶葉可分為綠茶、黃茶、黑茶、白茶、青茶、紅茶六大類。金莉莎也對(duì)六大茶類茶葉-石門銀峰、君山銀針、大紅袍、白毫銀針、信陽紅和茯磚的保健功能進(jìn)行了研究,建立腸道菌群失衡模型,探討六種茶葉對(duì)腸道菌群的調(diào)整作用,結(jié)果表明大紅袍、茯磚和信陽紅能夠有效調(diào)節(jié)腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量,具有恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡的作用[6]。

本實(shí)驗(yàn)通過建立高脂血癥小鼠模型,采集小鼠糞便,將六堡茶提取物與高脂小鼠糞便進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),探討六堡茶提取物對(duì)高脂血癥小鼠腸道菌群的影響。結(jié)果顯示,加入六堡茶提取物與高脂小鼠糞便進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后,各菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,總厭氧菌的數(shù)量與發(fā)酵0 h比較呈現(xiàn)顯著增長趨勢(shì),且在發(fā)酵至24 h,總厭氧菌的數(shù)量明顯超過了正常對(duì)照組,而總需氧菌數(shù)量在發(fā)酵36 h后,才發(fā)生顯著性變化,較0 h明顯降低了8.4%,并顯著低于正常對(duì)照組水平。其中,雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌和腸球菌的數(shù)量在發(fā)酵36 h后,與正常對(duì)照組相比無顯著性差異,均趨向于正常對(duì)照組水平,而大腸桿菌的數(shù)量雖呈降低趨勢(shì),但仍高于正常對(duì)照組。研究結(jié)果表明,六堡茶提取物能夠促進(jìn)高脂小鼠腸道菌群中厭氧菌的生長,并抑制需氧菌的繁殖,調(diào)節(jié)高脂飲食引起的小鼠腸道菌群紊亂。

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Effect of Liupao tea extract on fecal microbiota in hyperlipidemic mice

ZHAO Yuan-yuan,HUANG Li,WEI Bao-yao*,TENG Jian-wen,XIA Ning

(College of Light Industry and Food Engineering,Guangxi University,Nanning 530004,China)

The Liupao tea extract were cultured with fecalinvitroto investigate the effects of Liupao tea extract on intestinal flora in hyperlipidemia mice. The results showed that the number of total anaerobic incresed significantly compared with normal group with the extension of the fermentation time. While the number of total aerobic changed significantly after fermentation 36 h and significantly decreased 8.4% compared with fermentation 0 h. Among them,the number ofBifidobacterium,Lactobacillus,BacteroidesandEnterococcishowed no significant diffirence compared with normal group after fermentation 36 h,and tended to the normal group level. While the number ofE.colihad shown a decreasing trend,but still higher than the normal group level. The study indicated that the Liupao tea extract could promote anaerobic and inhibit aerobic bacteria in fat mice intestinal flora,regulate disorder of intestinal flora in high-fat diet-induced mice.

Liupao tea extract;fermentationinvitro;intestinal flora;hyperlipemia

2015-02-13

趙園園(1988-)，女，在讀碩士，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分功能性研究，E-mail:619992508@qq.com。

*通訊作者:韋保耀(1963-)，男，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)成分分離及化學(xué)結(jié)構(gòu)研究，E-mail:273417261@qq.com。

廣西自然科學(xué)基金(2012GXNSFBA053024)。

TS272.5

A

1002-0306(2015)21-0364-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.067