制備抗五氯酚鈉單克隆抗體及其應(yīng)用于酶聯(lián)免疫試劑盒的初步研究

劉 歡,馮才偉,賈芳芳,馮 靜,彭 鴿,張 瑜

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院,北京100141;2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司,北京 102206)

制備抗五氯酚鈉單克隆抗體及其應(yīng)用于酶聯(lián)免疫試劑盒的初步研究

劉 歡1,馮才偉2，*,賈芳芳2,馮 靜2,彭 鴿2,張 瑜2

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院,北京100141;2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司,北京 102206)

本文通過五氯酚鈉與4-溴丁酸乙酯經(jīng)過一系列反應(yīng),得到半抗原,制備出抗五氯酚鈉單克隆抗體,然后利用酶聯(lián)免疫技術(shù)研制了一種快速檢測魚肉、蝦肉中的五氯酚鈉試劑盒,經(jīng)過測試,該試劑盒對(duì)魚肉、蝦肉樣本的檢測限為0.75 μg/kg,IC50為0.31 μg/L,平均回收率為71.5%～104.7%,試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.05～4.05 μg/L,批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%,穩(wěn)定性良好。

五氯酚鈉,單克隆抗體,酶聯(lián)免疫試劑盒

五氯酚鈉是一種性質(zhì)穩(wěn)定的農(nóng)藥,可用于殺蟲、抗菌、防腐、除草等[1-3]。由于五氯酚鈉容易污染環(huán)境,并且容易在人體內(nèi)富集[4-5],因此,五氯酚鈉被美國列為可疑致癌物質(zhì),限制其使用;我國農(nóng)業(yè)部于2002年也將五氯酚鈉列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》,禁止在水生動(dòng)物養(yǎng)殖中使用[6-7]。

由此可見,研究水產(chǎn)中五氯酚鈉殘留量的檢測方法是有必要的。然而,目前現(xiàn)有的氣相色譜法、氣相色譜-電子捕獲法、氣相色譜-氫火焰法等儀器方法[8-14],由于其費(fèi)用昂貴及操作難度等缺點(diǎn),較難用于基層單位對(duì)大量樣本的篩查。因此,我們制備了抗五氯酚鈉單克隆抗體,并將其應(yīng)用于檢測魚肉、蝦肉等水產(chǎn)組織中五氯酚鈉含量的酶聯(lián)免疫試劑盒的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品 北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心;牛血清白蛋白、卵清蛋白、氫氧化鈉以及磷酸鹽 北京百欣試劑公司;魚肉、蝦肉 超市。

酶標(biāo)儀(最大量程為4.0) 上海雷勃分析儀器有限公司;渦旋儀、均質(zhì)器 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.2 制備抗原

1.2.1 制備半抗原 1.0 g五氯酚鈉與4-溴丁酸乙酯在DMF中,在無水碳酸鉀與碘化鈉的催化下,反應(yīng)生成五氯酚-4溴-丁酸乙酯產(chǎn)物,經(jīng)乙酸乙酯萃取,水洗,柱層析純化分離,得到中間產(chǎn)物,中間產(chǎn)物在氫氧化鉀的水溶液中加熱反應(yīng),水解生成半抗原,經(jīng)乙酸乙酯提取,二氯甲烷重結(jié)晶,得到半抗原產(chǎn)物。

圖1 五氯酚鈉半抗原合成Fig.1 Synthesis of pentachlorophenoI-Na hapten

1.2.2 制備免疫原——半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物合成 取18 mg半抗原,溶解于1 mL N,N-二甲基甲酰胺中,得到溶液(1),取氯甲酸異丁酯50 μL加入(1)中,4 ℃下攪拌30 min,得到反應(yīng)液A。稱取BSA 50 mg,使之充分溶解在4.0 mL PBS(pH7.2)中,將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中,并于室溫下攪拌24 h,用0.01 mol/L PBS 4 ℃透析3 d,每天換3次透析液,于-20 ℃保存?zhèn)溆?。通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是否偶聯(lián)成功。

1.2.3 制備包被原——半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)物合成 取18 mg半抗原,溶解于1 mL N,N-二甲基甲酰胺,得到溶液(1),取50 μL氯甲酸異丁酯加入(1)中,4 ℃下攪拌30 min,得到反應(yīng)液A。稱取50 mg的卵清蛋白,溶解于4.0 mL PBS(pH7.2)中,將反應(yīng)液A滴加到蛋白溶液中,室溫?cái)嚢?4 h,用0.01 mol/L PBS 4 ℃透析3 d,每天換3次透析液,于-20 ℃保存?zhèn)溆?。通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是否偶聯(lián)成功。

1.3 制備單克隆抗體以及酶標(biāo)記抗抗體

1.3.1 單克隆抗體的制備

1.3.1.1 動(dòng)物免疫 按照150 μg/只的免疫劑量將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi),從而獲得抗血清。

1.3.1.2 細(xì)胞融合和克隆化 測定小鼠血清,測定血清效價(jià),效價(jià)結(jié)果達(dá)到1∶2000～1∶1000,取小鼠脾細(xì)胞,按照8∶1的數(shù)量配比和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,利用間接競爭酶聯(lián)免疫法測定細(xì)胞上清液,進(jìn)行陽性孔篩選。通過有限稀釋法克隆化陽性孔,從而得到能夠分泌五氯酚鈉單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

1.3.1.3 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 用凍存液將1.3.1.2得到的單克隆雜交瘤細(xì)胞株制成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,用液氮保存。復(fù)蘇時(shí),將取出的凍存管立即放入37 ℃水浴中,離心去除凍存液,最后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.1.4 單克隆抗體的生產(chǎn)與純化 按照0.5 mL/只的滅菌石蠟油劑量注入Balb/c小鼠腹腔,一周后,按照5×105個(gè)/只的劑量向腹腔注射穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,一周后可采集腹水?？赏ㄟ^辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水。

1.3.2 酶標(biāo)記抗抗體的制備 將1.3.1得到的鼠源抗體免疫無病原體羊,得到羊抗鼠抗抗體[15],利用過碘酸鈉法,將其與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)[16],得到酶標(biāo)記抗抗體。

1.4 篩選抗原包被濃度以及單克隆抗體濃度

百分吸光率(%)=(標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液的平均吸光度值/0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值)×100。測定濃度為0,0.05 μg/L的五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光率,測定波長為450 nm,抗原稀釋倍數(shù)依次為:1∶2000,1∶4000,1∶8000;單克隆抗體稀釋倍數(shù)依次為:1∶50000,1∶100000,1∶200000,1∶400000;酶標(biāo)記抗抗體液的稀釋倍數(shù)為1∶1000。

1.5 制備酶標(biāo)板

將優(yōu)選濃度的抗原包被液100 μL包被于96孔酶標(biāo)板中,置于37 ℃,孵育2 h,洗板后,加入150 μL封閉液(0.05%BSA溶解于0.02mol/L PBS),置于37 ℃,孵育2 h。

1.6 魚肉、蝦肉的前處理方法

向1.0 g攪拌均勻的樣本中加入2 mL 0.1 mol/L NaOH,渦旋2 min,再加入8 mL乙腈,渦旋3 min,離心5 min,轉(zhuǎn)速為3000 r/min。取上清液1 mL到10 mL的玻璃試管中,50～60 ℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?再加入1.5 mL 0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液,渦旋30 s即可。

1.7 測定魚肉、蝦肉的OD450 nm值

向酶標(biāo)板每孔中加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 μg/L)和50 μL魚肉、蝦肉樣本,再加入適宜稀釋后的抗體液50 μL,25 ℃避光30 min。洗板后,每孔加入100 μL酶標(biāo)記抗抗體,25 ℃避光30 min。洗板后,每孔加入50 μL過氧化氫,再加入50 μL四甲基聯(lián)苯胺,25 ℃避光15 min。最后加入50 μL 2 mol/L H2SO4,測定酶標(biāo)板孔OD450 nm值。

1.8 魚肉、蝦肉中五氯酚鈉的實(shí)際濃度計(jì)算方法

分別以五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的對(duì)數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫、縱坐標(biāo),然后將魚肉、蝦肉的OD450 nm代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到相應(yīng)的濃度,該濃度乘以稀釋倍數(shù)即為魚肉、蝦肉中五氯酚鈉含量。

1.9 靈敏度和檢測限

分別檢測20份魚肉、蝦肉的空白樣本,利用空白樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算檢測限(LOD)。LOD是檢測方法可檢測出的最低被測物濃度,也稱為檢測低限或最小檢出濃度[17]。

1.10 精密度和準(zhǔn)確度

我國農(nóng)業(yè)部于2002年也將五氯酚鈉列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第193號(hào)),禁止在水生動(dòng)物養(yǎng)殖中使用?！掇r(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》對(duì)獸藥殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的備案技術(shù)資料要求:對(duì)于禁用藥物,添加濃度至少為1倍定量限和2倍定量限。定量限(LOQ)是指在精密度和正確度可接受的情況下檢測系統(tǒng)能夠得到可靠結(jié)果的被測物最低濃度,分析物在這個(gè)濃度下被可靠檢出[18]。分別對(duì)魚肉、蝦肉樣本添加五氯酚鈉,使其濃度達(dá)到1倍定量限和2倍定量限,測定添加回收率,用來考察準(zhǔn)確度。同時(shí),每個(gè)樣本做4個(gè)平行,包被3批酶標(biāo)板,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%),用來考察精密度。

1.11 穩(wěn)定性

將試劑盒存放在4 ℃,每個(gè)月測定一次,連續(xù)測定12個(gè)月;將試劑盒存放在37 ℃,每天測定一次,連續(xù)測定7 d。記錄試劑盒的最大吸光度值(0 μg/L)、50%抑制濃度以及1.5、3.0 μg/kg的添加魚肉、蝦肉空白樣本的回收率,評(píng)價(jià)不同時(shí)間、不同溫度對(duì)試劑盒的穩(wěn)定性影響。

1.12 交叉反應(yīng)率實(shí)驗(yàn)

2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、苯酚與五氯酚鈉具有類似結(jié)構(gòu)[19],對(duì)其進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度,用下式計(jì)算試劑盒對(duì)2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、苯酚的交叉反應(yīng)率:

交叉反應(yīng)率(%)=引起50%抑制的五氯酚鈉濃度/引起50%抑制的五氯酚鈉類似物濃度×100

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原與人工抗原的鑒定

2.1.1 鑒定半抗原 核磁共振氫譜測定已制備的五氯酚鈉半抗原,其質(zhì)子核磁共振(H-NMR)數(shù)據(jù):11.0(1H,COOH)、4.0(2H,Ph-O-CH2-)、2.0(2H,-CH2-)、2.3(2H,-CH2-COO-)譜圖見圖2。

圖2 五氯酚鈉半抗原核磁共振氫譜Fig.2 Proton NMR Spectra of pentachlorophenoI-Na hapten

取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測定,化學(xué)位移在4.0 ppm處的為鄰近酚氧的亞甲基信號(hào)峰,2.0 ppm處兩組為亞甲基信號(hào)峰,11 ppm處為羧基氫信號(hào)峰,說明半抗原合成成功[20-21]。

2.1.2 鑒定人工抗原 通過紫外掃描法鑒定人工偶聯(lián)抗原,見圖3、圖4。偶聯(lián)抗原、半抗原、載體蛋白的紫外吸收曲線各不相同,說明人工抗原有效偶聯(lián)。

圖3 五氯酚鈉半抗原-牛血清白蛋白的紫外吸收光譜Fig.3 Ultraviolet absorption spectrum of PCP-Na Hapten-BSA

圖4 五氯酚鈉半抗原-卵清蛋白的紫外吸收光譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of PCP-Na hapten-OVA

2.2 篩選抗原包被濃度以及單克隆抗體濃度

測定濃度為0 μg/L和0.05 μg/L的五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品的OD450 nm,見表1。

當(dāng)OD450 nm(0.05 μg/L)/OD450 nm(0 μg/L)的抑制率在70%～85%時(shí),以抗原、單克隆抗體的最大稀釋倍數(shù)作為抗原、單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)[22],由此可見,本研究中的最佳抗原稀釋倍數(shù)為4000,最佳單克隆抗體稀釋倍數(shù)為200000。

表1 抗原、抗體的濃度篩選(OD450nm)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)表明,標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為0.05～4.05 μg/L,IC50(50%抑制濃度)為0.31 μg/L;線性方程y=-0.7x+6.579,R2為0.9942。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的酶聯(lián)免疫法測定

表3 魚肉空白樣本檢測限測定結(jié)果(μg/L)

表4 蝦肉空白樣本檢測限測定結(jié)果(μg/L)

表5 魚肉、蝦肉精密度及準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

2.4 靈敏度和檢測限

本研究對(duì)魚肉、蝦肉樣本的檢測限為0.75 μg/kg，見表3、表4。

2.5 精密度和準(zhǔn)確度

測定添加不同濃度五氯酚鈉的魚肉、蝦肉樣本,平均回收率范圍是70.8%～90.2%,可見當(dāng)添加濃度為1.5、3.0 μg/kg時(shí),試劑盒符合農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號(hào)規(guī)定的回收率范圍大于40%或符合相應(yīng)檢測標(biāo)準(zhǔn)的要求,并且符合本實(shí)驗(yàn)平臺(tái)技術(shù)要求的60%～130%,即檢測樣本能夠得到可靠結(jié)果,LOQ=1.5 μg/kg,建立的LOD和LOQ的關(guān)系符合LOD≤LOQ[23];批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是5.7%～9.9%;批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是9.4%～9.8%，見表5。

2.6 穩(wěn)定性

將試劑盒分別保存在4 ℃和37 ℃,測定的試劑盒的最大吸光度值(0 μg/L)范圍是1.75～1.99,50%抑制濃度范圍是3.0～4.0 μg/L,五氯酚鈉添加回收率范圍是71.5%～104.7%,由此可見,各指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)，結(jié)果見表6、表7。從測定結(jié)果可知,該試劑盒在4 ℃至少能夠保存12個(gè)月,在37 ℃至少能夠保存7 d。

表6 試劑盒在4 ℃保存的穩(wěn)定性

表7 試劑盒在37 ℃保存的穩(wěn)定性

2.7 交叉反應(yīng)率實(shí)驗(yàn)

五氯酚鈉抗體與2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、苯酚的交叉反應(yīng)率見表8。

表8 交叉反應(yīng)率實(shí)驗(yàn)

由表8可知,五氯酚鈉抗體與2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、苯酚的交叉反應(yīng)率分別為1.6%,4.9%,0.3%。

3 討論

余宇燕[23-24]等采用了氯乙酸法合成五氯酚(PCP)的衍生物五氯苯氧乙酸半抗原,在此基礎(chǔ)上,采用活化酯法合成五氯酚的人工抗原,制備單克隆抗體。本文制備的五氯酚鈉半抗原結(jié)構(gòu)的間隔臂為4個(gè)碳長度的碳鏈,與蛋白結(jié)合后,能夠更大限度地暴露在其表面,突出小分子結(jié)構(gòu)特征,使免疫出的抗體具有更好的親和力。

GB 29708-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中五氯酚鈉殘留量的測定》使用氣相色譜-質(zhì)譜法測定動(dòng)物性食品中的五氯酚鈉殘留量,該方法的實(shí)驗(yàn)樣本為豬的肌肉、肝臟和腎臟及雞的肌肉和肝臟組織[25],未使用魚肉、蝦肉作為樣本。目前,尚未檢索到魚肉、蝦肉樣本中五氯酚鈉含量檢測的國家標(biāo)準(zhǔn),相關(guān)文獻(xiàn)也較少。因此,可為檢測水產(chǎn)樣本中五氯酚鈉提供一定的手段。

4 結(jié)論

本研究制備了抗五氯酚鈉單克隆抗體,并將其應(yīng)用于酶聯(lián)免疫試劑盒的開發(fā),通過一系列實(shí)驗(yàn),確定了最佳的抗原液濃度和單克隆抗體濃度,得到該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.05～4.05 μg/L,魚肉、蝦肉的檢測限為0.75 μg/kg,平均回收率為71.5%～104.7%。批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是5.7%～9.9%,批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是9.4%～9.8%,重現(xiàn)性較好。五氯酚鈉抗體與2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、苯酚的交叉反應(yīng)率分別為1.6%,4.9%,0.3%。穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)試劑盒質(zhì)量的一個(gè)重要方面[26-27],本研究的試劑盒在4 ℃能夠保存12個(gè)月,在37 ℃下能夠保存7 d,各項(xiàng)測定指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi),說明該試劑盒具有良好的穩(wěn)定性。

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Study on the production of pentachlorophenoi-na monoclonal antibodies and its enzyme linked immunosorbent assay kit for rapid detection

LIU Huan1,FENG Cai-wei2，*,JIA Fang-fang2,FENG Jing2,PENG Ge2,ZHANG Yu2

(1.Chinese Academy of Fishery Sciences,Beijing 100141,China;2. Beijing Kwinbon Biotechnology Company,Beijing 102206,China)

The synthesized pentachlorophenoI-na hapten was prepared from a sequence of reactions that used pentachlorophenoI-Na and 4-Bromobutyric acid ethyl ester. And pentachlorophenoI-Na monoclonal antibodies were prepared by pentachlorophenoI-Na antigen. Then the limit of detection and relative standard deviation(RSD)of pentachlorophenoI-Na enzyme linked immunosorbent assay kit was studied. The limit of detection was 0.75 μg/kg in fish and shrimp,with the IC50values of 0.31 μg/L. The average recoveries were between 71.5% and 104.7%. The standard curve ranged from 0.05 to 4.05 μg/L,and RSD was less than 10%. The stability tests results revealed that the kit can be kept for a long time.

PentachlorophenoI-Na;monoclonal antibodies;enzyme linked immunosorbent assay kit

2014-12-30

劉歡(1980-),女,博士,研究方向:水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)及管理,E-mail:liuh@cafs.ac.cn。

*通訊作者:馮才偉(1978-),男,碩士,研究方向:食品安全檢測技術(shù)研究,E-mail:fengcaiwei@kwinbon.com。

TS207.3

A

1002-0306(2015)21-0307-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.055