一株具有拮抗幽門螺桿菌作用的格氏乳桿菌生物學(xué)性質(zhì)及其在發(fā)酵乳中應(yīng)用

陳曉華,劉小鳴,王 剛,田豐偉,張 灝,陳 衛(wèi),*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;2.衡陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)系,湖南衡陽(yáng) 421008)

一株具有拮抗幽門螺桿菌作用的格氏乳桿菌生物學(xué)性質(zhì)及其在發(fā)酵乳中應(yīng)用

陳曉華1,2,劉小鳴1,王 剛1,田豐偉1,張 灝1,陳 衛(wèi)1,*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;2.衡陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)系,湖南衡陽(yáng) 421008)

本研究探討具有抗幽門螺桿菌作用的格氏乳桿菌的生物特性,結(jié)果表明L.gasseriChen在MRS培養(yǎng)基生長(zhǎng)比較慢,8 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,26 h后進(jìn)入穩(wěn)定期;最適生長(zhǎng)pH為5～7,最適生長(zhǎng)溫度為30～37 ℃,最適接種量為0.5%～2%(v/v),可在0.1%的膽鹽中生長(zhǎng),并能在5%的NaCl中生長(zhǎng)。在添加葡萄糖的復(fù)原乳中,L.gasseriChen能進(jìn)行單菌株發(fā)酵乳,且在4 ℃條件下可穩(wěn)定保存21 d;L.gasseriChen與普通酸奶發(fā)酵劑復(fù)合發(fā)酵制作的酸奶無(wú)不良風(fēng)味,表明L.gasseriChen可應(yīng)用于商業(yè)上生產(chǎn)功能性酸奶。

幽門螺桿菌,格氏乳桿菌,發(fā)酵乳,生物學(xué)性質(zhì)

幽門螺桿菌是一種螺旋狀、有鞭毛的革蘭氏陰性菌,我國(guó)居民感染率高達(dá)60%,且會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生胃炎、胃癌病癥。目前,抗生素治療有很多副作用,如耐藥性菌株產(chǎn)生、復(fù)發(fā)率高、產(chǎn)生腹瀉腹痛,擾亂胃腸道微生態(tài)平衡等。目前,不少研究利用益生菌進(jìn)行防治幽門螺桿菌的感染[1-2]。益生菌是一種或多種微生物組成的活菌培養(yǎng)物,可促進(jìn)動(dòng)物或人體原生微生物菌群生長(zhǎng)而對(duì)宿主產(chǎn)生有益的影響[3]。食品級(jí)的乳桿菌大部分可以作為益生菌,廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)學(xué)及化妝品領(lǐng)域,給經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大效益。乳桿菌在食品領(lǐng)域上作為益生菌一般具有兩個(gè)特性,第一具有耐酸,耐膽鹽的特性,其活菌在胃腸道中可以粘附或是短暫停留以發(fā)揮益生功能;第二具有某些特定的益生功能,如調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡、提供機(jī)體免疫功能或是抑制病原菌功能等。因此,乳桿菌作為益生菌在功能型發(fā)酵乳中應(yīng)用,需考察其這兩個(gè)方面的益生特性。

格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri,或稱加氏乳桿菌)是一種人類腸道和陰道中的內(nèi)在菌,桿狀、圓端,有時(shí)呈鏈狀,大小為(0.6～0.8)×(3.0～5.0)μm,革蘭氏陽(yáng)性菌,目前已被衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為益生菌在食品中應(yīng)用。格氏乳桿菌有多種益生功能,如格氏乳桿菌可以在女性陰道中分泌產(chǎn)生lactocillin,以此來(lái)殺滅陰道中的致病菌[4];格氏乳桿菌細(xì)胞壁可以調(diào)節(jié)因致病菌引起的不良炎癥反應(yīng)[5];格氏乳桿菌可以拮抗幽門螺桿菌感染[6]等。本研究對(duì)格氏乳桿菌(L.gasseriChen)拮抗幽門螺桿菌感染進(jìn)行相關(guān)的研究,結(jié)果表明在體外格氏乳桿菌能夠抑制幽門螺桿菌的生長(zhǎng)、尿素酶活性、抑制幽門螺桿菌粘附胃上皮細(xì)胞,格氏乳桿菌拮抗幽門螺桿菌作用與其代謝的細(xì)菌素有關(guān)等研究[7-8]。為了探求L.gasseriChen能否作為益生菌應(yīng)用于酸奶加工中,本研究探討其生物學(xué)特性和發(fā)酵特性,旨在為開(kāi)發(fā)干預(yù)幽門螺桿菌感染的酸奶生產(chǎn)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ),為藥食同源法防治幽門螺桿菌感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

格氏乳桿菌(L.gasseriChen)由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏中心;酸奶發(fā)酵劑(LB340和TA460) 丹尼斯克公司。MRS培養(yǎng)基 青島海博公司;牛膽汁粉 上海生工;奶粉 上海光明乳業(yè)。

UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼科上海有限公司;DMB5顯微鏡(Motic China Group Co.,Ltd);SW-CJ-1CV超凈臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;滅菌鍋(SANYO Electric Co.,Ltd);320-S pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;NDJ-79型粘度儀 同濟(jì)大學(xué)機(jī)電廠;TA-XT2質(zhì)構(gòu)測(cè)試儀(STab. Micro System,Godalming UK);5415R離心機(jī)(Eppendorf);小型冷凍離心機(jī)(Germany Hettich Co.,Ltd)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的制備 將L.gasseriChen接入MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,連續(xù)培養(yǎng)2代,獲得新鮮培養(yǎng)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸菌生物學(xué)特性研究 不同溫度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響[9-10]:取對(duì)數(shù)期的菌株按1%(v/v)接種量接入到MRS液體培養(yǎng)基,分別于不同溫度(15～42 ℃)下厭氧培養(yǎng)18 h,測(cè)定培養(yǎng)物在600 nm波長(zhǎng)處的OD值。

最初pH對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響[9-10]:活化后的菌株培養(yǎng)液離心(6000 r/min,10 min),收集菌體,用滅菌PBS(pH7.4)離心洗滌2次,按1%(v/v)接種量接入不同pH(2.0～7.0)的MRS液體培養(yǎng)基中,在37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h,測(cè)定培養(yǎng)物在600 nm波長(zhǎng)處的OD值。

不同接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響[9-10]:將活化的菌株按不同的接種量(0.5%～10%)接入MRS培養(yǎng)基,37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h,測(cè)定培養(yǎng)物在600 nm波長(zhǎng)處的OD值。

菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定[9-10]:取對(duì)數(shù)期的菌株按1%(v/v)接種量接入MRS培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng),每隔2 h取樣,測(cè)定培養(yǎng)物在600 nm波長(zhǎng)處的OD值。

菌株對(duì)膽汁耐受性的測(cè)定[9-10]:取對(duì)數(shù)期的菌按1%(v/v)接種量接入含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0～0.45%)牛膽汁粉的MRS培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h,測(cè)定培養(yǎng)物在600 nm波長(zhǎng)處的OD值。

菌株對(duì)NaCl耐受性的測(cè)定[9-10]:取對(duì)數(shù)期的菌按1%(v/v)接種量接入到含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0～9%)NaCl的MRS培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h,測(cè)定培養(yǎng)物在600 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.2.3 發(fā)酵乳樣品的制備 單菌株發(fā)酵:活化的L.gasseriChen菌株培養(yǎng)液6000 r/min,10 min離心,收集菌體,用滅菌PBS離心洗滌2次,以2%(v/v)的接種量接種到已滅菌的12%(w/v)的脫脂乳(含1%葡萄糖)中,在42 ℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)[11]。

復(fù)合菌株發(fā)酵:全脂復(fù)原乳(1%葡萄糖,蔗糖6.5%,全脂粉11.5%)預(yù)熱到60 ℃,高壓均質(zhì)(20 MPa)兩次后,攪拌煮沸滅菌,自然冷卻到42 ℃并接入發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌LB340和嗜熱鏈球菌TA460)和L.gasseriChen(菌株接種量均為2×107CFU/g),放入42 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵10 h,冷卻至4 ℃保藏24 h[11]。

1.2.4 發(fā)酵乳理化指標(biāo)測(cè)定 發(fā)酵乳滴定酸度的測(cè)定:10 g的酸奶樣品,置于100 mL的三角瓶中,加入20 mL水和0.5 mL 0.5%的酚酞溶液,搖勻,用0.1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色,并在1 min內(nèi)不消失為止。消耗的0.1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)乘以10,即得滴定酸度(°T),取三次測(cè)定的算術(shù)平均值[11]。

發(fā)酵乳粘度的測(cè)定:采用NDJ-5S型粘度計(jì)、10x的轉(zhuǎn)子在25 ℃進(jìn)行測(cè)定,取三次測(cè)定的算術(shù)平均值[12]。

發(fā)酵乳脫水收縮的測(cè)定:稱取15.0 g發(fā)酵乳樣品,置于帶有濾紙的漏斗中,21 ℃放置90 min,收集濾液并稱重[12]。

脫水收縮率(%)=(濾液重g/樣品重量g)×100

發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)的測(cè)定:將發(fā)酵乳樣品調(diào)溫至20～22 ℃,采用TA-XT2質(zhì)構(gòu)測(cè)試儀SMS P/25平底柱形探頭進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件:測(cè)前速率5.0 mm/s、測(cè)試速率2.0 mm/s、測(cè)后速率2.0 mm/s,探頭進(jìn)入距離為20 mm,兩次壓縮之間的停留時(shí)間為5 s。利用質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算得到硬度、凝聚性和黏著性[12]。

發(fā)酵乳活菌數(shù)的測(cè)定:取0.5 g發(fā)酵乳樣品,用滅菌生理鹽水梯度稀釋后,采用選擇培養(yǎng)基平板傾注法,測(cè)定活菌數(shù)量。采用M17固體培養(yǎng)基計(jì)算球菌數(shù),采用MRS固體培養(yǎng)基計(jì)算桿菌數(shù)[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株生理特性研究

2.1.1 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 乳桿菌一般在溫度30～37 ℃生長(zhǎng)良好,有些菌株甚至可以在10 ℃生長(zhǎng)。但應(yīng)用于制作食品的乳桿菌不宜具有低溫下生長(zhǎng)的能力,因?yàn)槿闂U菌在低溫下生長(zhǎng)的性能會(huì)致使產(chǎn)品的貯藏時(shí)間縮短,影響產(chǎn)品的品質(zhì)。因此,需探求不同培養(yǎng)溫度下對(duì)L.gasseriChen菌株生長(zhǎng)的影響。L.gasseriChen菌株在溫度為20～42 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度為30～37 ℃,在此溫度下,培養(yǎng)液的pH在4.2左右(見(jiàn)表1)。

表1 不同溫度對(duì)L. gasseri Chen菌株生長(zhǎng)的影響

注:abcd不同字母表示同一列方向在p=0.05水平上顯著性差異,表2同。

2.1.2 不同接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 不同接種量對(duì)L.gasseriChen菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表2,L.gasseriChen菌株的生長(zhǎng)隨著接種量的增大呈下降趨勢(shì),最適接種量在0.5%～2%之間,此接種量下,培養(yǎng)液的pH在4.0左右。

表2 不同接種量對(duì)L. gasseri Chen菌株菌株生長(zhǎng)的影響

2.1.3 菌株最適生長(zhǎng)pH 人的胃的pH一般在1～4,作為益生菌的前提條件應(yīng)該具備一定的耐酸性。因此,考察不同pH對(duì)L.gasseriChen菌株生長(zhǎng)的影響。如圖1,L.gasseriChen生長(zhǎng)的pH比較廣,在高于pH3范圍內(nèi)都能很好的生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)pH為6～7。L.gasseriChen在pH2～3之間,生長(zhǎng)很不好,但是在pH2的人工胃液中存活率達(dá)到2%左右[2],可見(jiàn)還是具有潛在益生菌性質(zhì)。

圖1 不同pH對(duì)菌株L. gasseri Chen生長(zhǎng)的影響Fig.1 The growth effect of L. gasseri Chen in different pH

2.1.4 菌株生長(zhǎng)曲線L.gasseriChen菌株在MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2,L.gasseriChen則生長(zhǎng)比較慢,該接種量下8 h才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,26 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。相較于其他乳酸菌,如植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌而言[13],L.gasseriChen菌株延滯期比較長(zhǎng),但最終L.gasseriChen在MRS生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)也能達(dá)到109CFU/mL。

圖2 L. gasseri Chen在MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig. 2 The growth curve of L. gasseri Chen in the media of MRS

2.1.5 菌株耐受膽汁的能力 微生物能夠在腸道中存活、生長(zhǎng)并發(fā)揮功效,必須具有耐受膽鹽特性。人體消化道中因部位不同,膽鹽的含量也不同,一般而言,人體小腸中膽鹽的含量在0.03%～0.3%之間,能夠在正常生理膽鹽濃度中生長(zhǎng)和代謝的菌株才可能在腸道中存活[13]。L.gasseriChen膽鹽耐受力不高,但還是能夠在膽鹽濃度為0.1%的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(見(jiàn)表3)。

表3 L. gasseri Chen菌株膽鹽耐受力

注:++表示培養(yǎng)基在24 h內(nèi)變色,+表示培養(yǎng)基在48 h內(nèi)變色,-表示培養(yǎng)基不變色。

2.1.6 菌株耐受NaCl的能力 乳酸菌耐受NaCl的能力見(jiàn)表4,L.gasseriChen能在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaCl溶液中正常生長(zhǎng),pH為4.2左右。

表4 L. gasseri Chen菌株的NaCl耐受力

注:+表示可生長(zhǎng),++表示生長(zhǎng)很好,-表示不能生長(zhǎng)。

2.2 格氏乳桿菌在乳制品中的應(yīng)用

2.2.1 單菌株發(fā)酵分析L.gasseriChen在含有葡萄糖的脫脂乳中單獨(dú)發(fā)酵,發(fā)酵過(guò)程中pH、滴定酸度和活菌數(shù)變化見(jiàn)圖3、圖4。如圖所示,乳酸菌在42 ℃、24 h發(fā)酵過(guò)程中,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),活菌數(shù)和滴定酸度升高,pH降低。但在脫脂乳中生長(zhǎng)并不是很好,大約僅增加0.6個(gè)對(duì)數(shù)值?？梢?jiàn),L.gasseriChen并不適合單獨(dú)作為發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵乳,應(yīng)與商業(yè)發(fā)酵劑聯(lián)用制作功能型發(fā)酵乳。

圖3 L. gasseri Chen的單菌落發(fā)酵乳pH和滴定酸度的變化Fig. 3 The pH and titratable acidity curves of L. gasseri Chen fermented milk

圖4 L. gasseri Chen的單菌落發(fā)酵乳菌落數(shù)變化Fig.4 The count curve of L. gasseri Chen fermented milk

2.2.2 單菌株發(fā)酵乳存儲(chǔ)期變化分析L.gasseriChen單菌株發(fā)酵乳在4 ℃保存21 d(見(jiàn)圖5),pH、菌落數(shù)和脫水收縮性都無(wú)顯著變化,但是滴定酸度有所增加,這可能跟菌株的后酸化以及風(fēng)味的形成有關(guān),但影響并不大。因此,L.gasseriChen菌株可應(yīng)用于酸奶發(fā)酵中。

圖5 L. gasseri Chen單菌落發(fā)酵乳儲(chǔ)藏期理化指標(biāo)Fig.5 The physical characterizations of L. gasseri Chen fermented milk in the storage

2.2.3 復(fù)合菌株發(fā)酵乳品質(zhì)分析 乳酸菌L.gasseriChen與商業(yè)菌株保加利亞乳桿菌(LB340)和嗜熱鏈球菌(TA460)復(fù)合發(fā)酵如表5所示。L.gasseriChen分別與商業(yè)菌株復(fù)合發(fā)酵時(shí),凝乳時(shí)間比單菌株發(fā)酵有所提前。冷藏24 h后的酸乳,滴定酸度大約在100 °T左右;pH大約是在4.2左右;菌落數(shù)在109CFU/g左右;粘度在3700 Pa·s左右。對(duì)復(fù)合菌株發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵乳的黏著性比較好,L.gasseriChen的復(fù)合發(fā)酵乳的硬度和凝聚性比較好,硬度則相差不大。但整體而言,復(fù)合發(fā)酵乳與普通酸奶品質(zhì)上差異并不大?？梢?jiàn),添加L.gasseriChen菌株進(jìn)行酸奶制作,對(duì)產(chǎn)品的理化指標(biāo)影響不大,但卻有特殊的生理功能,具有開(kāi)發(fā)功能型發(fā)酵乳的潛質(zhì)。

表5 復(fù)合發(fā)酵乳在4 ℃冷藏24 h后理化指標(biāo)

3 結(jié)論

本研究探討具有抗幽門螺桿菌作用的格氏乳桿菌(L.gasseriChen)的生物特性,并初步研究L.gasseriChen在乳制品中應(yīng)用。L.gasseriChen生長(zhǎng)比較慢,8 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,26 h后進(jìn)入穩(wěn)定期;最適生長(zhǎng)pH為5～7,最適生長(zhǎng)溫度為30～37 ℃,最適接種量為0.5%～2%(v/v),可在0.1%的膽鹽中生長(zhǎng),并能在5%的NaCl中生長(zhǎng)。L.gasseriChen可在添加葡萄糖的牛乳中生長(zhǎng),但生長(zhǎng)增殖量不大,單菌株發(fā)酵乳在4 ℃條件下可保存21 d,理化性質(zhì)相對(duì)比較穩(wěn)定。L.gasseriChen與商業(yè)菌株復(fù)合發(fā)酵制作的發(fā)酵乳,在滴定酸度、pH、粘度和總菌數(shù)等理化指標(biāo)方面無(wú)差別,同時(shí)質(zhì)構(gòu)分析也無(wú)顯著差別?？梢?jiàn)L.gasseriChen與商業(yè)菌株復(fù)合發(fā)酵制作酸奶無(wú)不良影響,可應(yīng)用于商業(yè)上生產(chǎn)功能性酸奶。

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Study on the biological characteristics ofLactobacillusgasseriwith antagonistic activity againstHelicobacterpyloriand application in the yoghurt produce

CHEN Xiao-hua1,2,LIU Xiao-ming1,WANG Gang1,TIAN Feng-wei1,ZHANG Hao1,CHEN Wei1,*

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Life Science,Hengyang Normal University,Hengyang 421008,China)

The aim of present study was to discuss the application and biological characteristics ofL.gasseriChen with antagonistic activity againstH.pylori. Biological characteristics research ofL.gasseriChen showed that the logarithmic time was from 8th hour to 26th hour. The optimum growth pH 5～7. The optimum growth temperature was 30～37 ℃.The optimum inoculated concentration was 0.5%～2%(V/V),and the tolerance level of bile salt was 0.1%(V/V).L.gasseriChen could grow and ferment in the milk with glucose and the fermented milk could store stably in the 4 ℃ for 21 days.L.gasseriChen also could ferment in milk with commercial starters without bad affects,which indicated thatL.gasseriChen could be used to produce functional yoghurt.

Helicobacterpylori;Lactobacillusgasseri;yoghurt;biological characteristic

2015-04-07

陳曉華(1981-)，女，博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù),E-mail:chxh0217@163.com。

*通訊作者:陳衛(wèi)(1966-)，男，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD28B07)；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015JJ6012)；糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目資助；衡陽(yáng)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014KN54)；湖南省教育廳資助科研項(xiàng)目(15B034)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0148-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.022