苦瓜藤中苦瓜素Ⅰ的分離鑒定和抑菌作用

葛曉環(huán),余 平,曾哲靈,劉 兵

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江西南昌330031；3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,江西南昌330031)

苦瓜藤中苦瓜素Ⅰ的分離鑒定和抑菌作用

葛曉環(huán)1,2,余 平3,*,曾哲靈1,3，*,劉 兵3

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江西南昌330031；3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,江西南昌330031)

本文研究苦瓜藤的三萜類化學(xué)成分及其抑菌作用。采用75%(v/v)乙醇提取及D101大孔樹脂、硅膠、MCI樹脂和ODS硅膠等多種吸附分離方法從苦瓜藤中分離三萜類化合物,經(jīng)超高效液相、電噴霧質(zhì)譜、核磁共振測定、分析所得三萜類化合物的純度、分子量及結(jié)構(gòu),采用肉湯稀釋法測定所得三萜類化合物的抑菌活性。結(jié)果表明:苦瓜藤中分離的三萜類化合物經(jīng)鑒定為19-Norlanosta-5,24-diene-9-carboxaldehyde,3,7,23-trihydroxy-,(3β,7β,9β,10α,23α)-,俗名苦瓜素Ⅰ;苦瓜素Ⅰ對大腸桿菌(EscherichiacoliAB1157)無顯著抑菌活性,MIC值大于100 μg/mL。其對金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusNewman)的生長具有抑制作用,MIC值達(dá)到12.5～25 μg/mL。

苦瓜藤,苦瓜素Ⅰ,分離,鑒定,抑菌

苦瓜是一種一年生的攀援草本,莖細(xì)長。其作為一種蔬菜廣泛種植于熱帶,亞熱帶地區(qū)。其果實常被用于輔助治療糖尿病。對其化學(xué)成分的研究顯示,其果實、莖、葉、根和種子含有大量的葫蘆烷型三萜類化合物[1-5]、少量的甾體化合物[6]、生物堿及其他類化合物[7]。相關(guān)藥理研究表明苦瓜粗提物和部分三萜類化合物具有降糖作用[1,8-9]、抗腫瘤作用[10-12]、抗氧化作用[3,13]和減肥作用[14-15]。

有關(guān)苦瓜及其藤中生物活性物質(zhì)抑菌作用的研究報道僅限于苦瓜提取物和總皂苷[16-19]、苦瓜葉提取物[20],苦瓜藤提取物[20-21],還未見有關(guān)苦瓜藤中三萜類單體化合物抑菌作用的研究報道。研究苦瓜藤中三萜類化合物的抑菌作用,對充分利用苦瓜藤資源,變廢為寶具有重要意義。本文采用萃取、吸附分離方法自苦瓜藤中分離出三萜類化合物,采用超高效液相、電噴霧質(zhì)譜、核磁共振一維譜等方法分析所得三萜類化合物結(jié)構(gòu),并采用肉湯稀釋法研究化合物的抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦瓜藤粉末(過40目篩) 產(chǎn)于江西吉安;大腸桿菌(EscherichiacoliAB1157),金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusNewman) 由國家新藥篩選中心提供;D101大孔吸附樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司;GF254硅膠板,柱層析硅膠 青島海洋化工廠分廠;MCI樹脂 日本三菱化學(xué)株式會社;十八烷基鍵合硅膠(Octadecylsilyl silica gel,ODS silica gel) 日本YMC有限公司;甲醇,二氯甲烷,三氯甲烷,硫酸,乙醇,氯化鈉,二甲亞砜 廣東西隴化工股份有限公司,分析純;高氯酸 天津市鑫源化工有限公司,分析純;香草醛 天津市大茂化學(xué)試劑廠,分析純;乙腈 德國CNW公司,色譜純;氘代吡啶 美國Cambridge Isotope Laboratories公司;96孔板(透明) 美國corning公司,對照樣品DMSO溶液為卡那霉素(30 mg/mL)、萬古霉素(4 mg/mL)、四環(huán)素(5 mg/mL) 由國家新藥篩選中心提供。

超高效液相色譜儀(Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC)Agilent1290,配蒸發(fā)光散射檢測器(Evaporative Light Scattering Detector,ELSD) 美國Agilent公司;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS(Mass Spectrum)),Agilent 6538 Q-TOF System) 美國Agilent公司;核磁共振儀(Nuclear Magnetic Resonance(NMR),Bruker Avance Ⅲ 600 MHz) 德國Bruker公司;50L雙層玻璃提取罐 武漢世紀(jì)超杰實驗儀器有限公司;SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備總廠;WFZ765PC型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;BS223S型電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;Synergy H1 全功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司;GeneQuant 100紫外分光光度計 美國GE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦瓜藤中三萜類化合物的提取分離 稱取16 kg苦瓜藤粉末分批置于50 L提取罐中,在提取溫度為60 ℃、料液比(苦瓜藤粉∶乙醇)為1∶10的條件下,用75%(v/v)乙醇浸提2 h,過濾,然后在濾渣中繼續(xù)加入75%(v/v)乙醇浸提,過濾,反復(fù)提取直至用香草醛-高氯酸法[22]檢測不出濾液中三萜類化合物為止,合并濾液,真空濃縮得粗提物浸膏1312 g。

浸膏上預(yù)先處理好的D101大孔吸附樹脂柱[22](16 cm×100 cm),先用蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)。再用20%(v/v)、40%(v/v)、60%(v/v)、80%(v/v)、95%(v/v)的乙醇梯度洗脫(每個梯度洗脫50 L),分別收集各洗脫部分,真空濃縮干燥,采用香草醛-高氯酸法測定三萜類化合物含量,結(jié)果顯示:80%(v/v)乙醇洗脫部分(200 g)含有大量三萜類化合物。

取該洗脫部分甲醇溶解,硅膠拌樣,旋干后上預(yù)處理好的硅膠色譜柱,用0%(v/v)～30%(v/v)的甲醇-二氯甲烷溶劑體系梯度洗脫,采用薄層層析法(TLC)跟蹤合并Rf值和顯色均相同的洗脫液,5%(v/v)的甲醇-二氯甲烷溶劑體系洗脫部分共計41.2 g。

該部分配制成1 g/mL的甲醇溶液后過濾,濾液上預(yù)處理好的MCI樹脂柱,10%(v/v)～100%(v/v)的甲醇-水溶劑體系梯度洗脫,TLC跟蹤合并Rf值和顯色均相同的洗脫液,90%(v/v)的甲醇-水溶劑體系洗脫部分標(biāo)記為A,(27g);A部分重復(fù)上樣、梯度洗脫,TLC跟蹤合并Rf值和顯色均相同的洗脫液,80%(v/v)～85%(v/v)的甲醇-水溶劑體系洗脫部分標(biāo)記為A1,共計20.8 g。

取1.5 g A1部分甲醇復(fù)溶后上預(yù)處理好的ODS色譜柱,30%(v/v)～100%(v/v)的甲醇-水溶劑體系梯度洗脫,TLC跟蹤合并Rf值和顯色均相同的洗脫液,得到單體化合物T2(325 mg),計算得率約為0.028%。

1.2.2 化合物T2的純度及結(jié)構(gòu)分析

1.2.2.1 UPLC測定化合物T2的純度 根據(jù)文獻(xiàn)[23]的方法并稍加改動。稱取5.0 mg化合物T2,溶于5 mL甲醇中,配制成1.0 mg/mL的溶液,過濾,待測。采用UPLC測定化合物T2的純度。UPLC測試條件為:色譜柱:ZORBAX SB-C18,1.8 μm,50×2.1 mm;流速:0.3 mL/min;溫度25 ℃;時間:25 min;流動相:乙腈∶水(10∶90～100∶0);進(jìn)樣量:3 μL;檢測器:蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD),噴霧器流速1.8 L/min,噴霧器溫度30 ℃,漂移管溫度40 ℃。

1.2.2.2 MS測定化合物T2的分子量 稱取1.0 mg化合物T2,溶于5 mL甲醇中,配制成0.2 mg/mL的溶液,過濾,待測。采用MS測定化合物T2的分子量。MS測試條件為:離子源:電噴霧(ESI);霧化壓力:40psi;干燥器流速:10 L/min;干燥器溫度:350 ℃;分流比:1∶3;添加少量甲酸。

1.2.2.3 NMR測定化合物T2的結(jié)構(gòu) 稱取5 mg化合物T2溶于0.5 mL氘代吡啶(pyridine-d5)中,得10 mg/mL的待測樣品溶液,采用NMR測定該化合物的氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)、無畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)譜(DEPT)。

1.2.3 化合物T2的抑菌作用 根據(jù)文獻(xiàn)[24]的方法測定化合物的抑菌作用。稱取化合物T2 1 mg左右,用DMSO溶解至10 mg/mL母液,-20 ℃保存。分別取S.aureusNewman、E.coliAB1157單克隆在37 ℃過夜培養(yǎng);分光光度計測定OD600值,分別用相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋菌液至OD600=0.01,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)5～8 h,至OD600=0.6(所對應(yīng)的菌落個數(shù)大概在(5～10)×107個/毫升);化合物按照相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋到工作濃度;菌液稀釋400倍后,取50 μL加至透明底微孔板上50 μL含有化合物的培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng),16 h后酶標(biāo)儀測定OD600值,確定有無細(xì)菌生長,計算MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 化合物T2的理化性質(zhì) 化合物T2為白色無定形粉末,易溶于甲醇、乙醇,紫外254 nm處無吸收,采用兩種展開劑展開,均為一個點(展開劑：三氯甲烷∶甲醇=100∶8,三氯甲烷∶丙酮=3∶1)。香草醛-高氯酸法顯色呈藍(lán)紫色,提示為三萜類化合物。

2.1.2 化合物T2的純度 UPLC-ELSD結(jié)果如圖1所示:化合物T2的保留時間(tR)為11.748 min,且純度高于99%,達(dá)到進(jìn)行核磁共振檢測所需純度。

圖1 化合物T2的UPLC-ELSD圖譜Fig.1 The UPLC-ELSD chromatogram of compound T2

2.1.3 化合物T2的分子量 化合物T2的高分辨ESI-MS結(jié)果顯示:準(zhǔn)分子離子峰m/z為495.3353[M+Na]+、507.3291[M+Cl]-。

2.1.4 化合物T2的結(jié)構(gòu)解析1H-NMR譜顯示:該化合物存在7個甲基,四個甲基連在季碳上(0.90,0.95,1.21,1.51),2個甲基連在烯碳上(1.71,1.73),1個甲基連在次甲基上(1.18(d,J=6 Hz)),3個質(zhì)子連在結(jié)構(gòu)上有羥基的碳上(3.85(1H,brs),4.39(1H,d,J=6 Hz),4.85(1H,m)),其中至少有一個緊挨著烯碳,有一個連在季碳上的醛基質(zhì)子(10.70),13C-NMR譜和DEPT譜顯示:有三個羥甲基碳(76.2,66.2,65.6),四個三取代雙鍵碳(146.2,124.8,132.4,131.3)和一個醛基碳(208.3)。這些數(shù)據(jù)提示該化合物為葫蘆烷型三萜類化合物。氫譜,碳譜,結(jié)合高分辨率質(zhì)譜m/z 507.3291[M+Cl]-(計算值507.3241),可得分子式為C30H48O4。化合物氫譜δH值,碳譜δC值與已報道的化合物19-Norlanosta-5,24-diene-9-carboxaldehyde,3,7,23-trihydroxy-,(3β,7β,9β,10α,23α)-[25-26]的數(shù)據(jù)一致,故確定化合物T2與該化合物結(jié)構(gòu)一致,俗名為苦瓜素Ⅰ(momordicineⅠ)(圖2)。

圖2 苦瓜素Ⅰ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structure of momordicineⅠ

2.2 抑菌作用分析

由表1可知,苦瓜素Ⅰ對大腸桿菌(EscherichiacoliAB1157)無顯著抑菌活性,MIC值大于100 μg/mL。其對金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusNewman)的生長具有抑制作用,其MIC值達(dá)到12.5～25 μg/mL。Rakholiya等人[21]發(fā)現(xiàn)苦瓜藤葉水提取物和醇提取物對金黃色葡萄球菌等多種菌株有抑制作用，且醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用比水提取物要好。這與本實驗結(jié)論一致。而且本實驗進(jìn)一步闡明了苦瓜藤脂溶性提取物抑菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)包括苦瓜素Ⅰ。張靜雅等人[27]發(fā)現(xiàn)苦瓜的70%乙醇提取物對革蘭氏陽性菌的抑菌活性明顯優(yōu)于革蘭氏陰性菌,對金黃色葡萄球菌的抑制效果強(qiáng),對大腸桿菌抑制作用較弱。由于苦瓜皂苷的苷元部分結(jié)構(gòu)[1,28-29]與苦瓜素Ⅰ相同或相似,提示苦瓜素Ⅰ和苦瓜皂苷的抑菌作用可能有相同的作用機(jī)制。

表1 苦瓜素Ⅰ的MIC測定

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明,苦瓜藤中含有的苦瓜素Ⅰ是其粗提物抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一,苦瓜素Ⅰ對金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusNewman)有抑菌效果。這為苦瓜藤中天然抑菌物質(zhì)的開發(fā)與研究提供了依據(jù)。這方面的深入研究有望為苦瓜藤的綜合利用開辟一條新的途徑。

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Separation,identification and its antibacterial activity of momordicineⅠfrom the vine ofMomordicaCharantiaL.

GE Xiao-huan1,2,YU Ping3,*,ZENG Zhe-ling1,3,*,LIU Bing3

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2. School of Life Science and Food Engineering,Nanchang University,Nanchang 330031,China；3.School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang University,Nanchang 330031,China)

The study was aimed to determine the structure and antibacterial activity of triterpenoids from the vine ofMomordicaCharantiaL.. The 75% ethanol(v/v)was used to extract total triterpenoids from the vine ofMomordicaCharantiaL.. The monomer compound was separated by means of solvent extraction,D101 macroporous adsorption resin column chromatography followed by MCI gel,silica gel and Octadecylsilyl silica gel(ODS silica gel column chromatography). The structure was determined by UPLC,ESI-MS,1D-NMR. The compound was identified as 19-Norlanosta-5,24-diene-9-carboxaldehyde,3,7,23-trihydroxy-,(3β,7β,9β,10α,23α)-,whose common name was momordicineⅠ. Then the broth dilution method was used to test the minimum inhibitory concentrations(MIC)of triterpenoids. MomordicineⅠhad no significant antibacterial activity againstEscherichiacoliAB1157. Its MIC were more than 100 μg/mL.MomordicineⅠexhibited the inhibitory effect againstStaphylococcusaureusNewman,its MIC were ranged from 12.5 μg/mL to 25 μg/mL.

vine ofMomordicaCharantiaL.;momordicineⅠ;seperation;identification;antibacterial activity

2014-08-20

葛曉環(huán)(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：15879173869@163.com。

*通訊作者:余平(1982-)，男，博士，講師，研究方向：藥食同源植物資源開發(fā)，E-mail：cpu_yuping@126.com。 曾哲靈(1965-)，男，博士，教授，研究方向：食物資源開發(fā)與生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，E-mail：zlzengjx@163.com。

南昌大學(xué)科研啟動經(jīng)費(06301081)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)21-0118-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.016