腎損傷分子-1在腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷中的保護(hù)作用*

霍文謙，張克勤

(第三軍醫(yī)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科，重慶 400042)

腎損傷分子-1在腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷中的保護(hù)作用*

霍文謙，張克勤△

(第三軍醫(yī)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科，重慶 400042)

目的 觀察腎損傷分子-1(KIM-1)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷時(shí)增殖及凋亡的影響，證實(shí)KIM-1對(duì)腎缺氧損傷的保護(hù)作用。方法 以人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2為研究對(duì)象，用pcDNA-hKIM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)KIM-1的pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞株。觀察pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞(A組)和KIM-1抗體預(yù)處理pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞(C組)在缺氧損傷后細(xì)胞活力、凋亡指標(biāo)及凋亡相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)，以未轉(zhuǎn)染缺氧HK-2細(xì)胞(B組)作為對(duì)照。結(jié)果 A組細(xì)胞活力指數(shù)高于B組(0.427±0.046vs.0.210±0.036，P<0.05)，細(xì)胞凋亡數(shù)量及流式細(xì)胞儀檢測(cè)的缺氧早、晚期凋亡指數(shù)明顯低于B組(P<0.05)。A組細(xì)胞缺氧時(shí)磷酸化ERK、磷酸化Akt表達(dá)較C組明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 KIM-1對(duì)腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與激活PI3K-Akt/PKB和ERK信號(hào)通路抑制凋亡有關(guān)。

腎損傷分子1；腎小管上皮細(xì)胞；缺氧損傷；保護(hù)效應(yīng)

腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)的發(fā)現(xiàn)為診斷腎缺氧損傷提供了理想的特異性預(yù)警分子，也帶來(lái)了新的治療靶點(diǎn)。新近研究發(fā)現(xiàn)KIM-1不僅是一種診斷腎損傷的特異性標(biāo)志物，還可能作為一種保護(hù)性分子參與了腎損傷修復(fù)過(guò)程，因?yàn)镵IM-1與某些增殖標(biāo)志物共表達(dá)，另外KIM-1可能通過(guò)吞噬凋亡小體減輕腎小管梗阻[1]。但迄今關(guān)于KIM-1在腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷中的保護(hù)作用尚無(wú)直接證據(jù)。本研究通過(guò)建立pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞株，觀察KIM-1在HK-2細(xì)胞缺氧損傷中的效應(yīng)，從而提供KIM-1對(duì)腎小管缺氧損傷保護(hù)作用的直接證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2(上海復(fù)祥生物科技有限公司)，pcDNA-hKIM-1質(zhì)粒(哈弗醫(yī)學(xué)院Ichimura教授饋贈(zèng))，人KIM-1 ELISA Kit 96T(上海滬尚生物科技有限公司)，鼠抗人KIM-1單克隆抗體(Sigma公司)，Hoechst染色試劑盒(上海BestBio)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000(Lnvitrogen公司)，流式細(xì)胞儀(Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞株的建立 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用質(zhì)粒抽提試劑盒獲得超純質(zhì)粒。HK-2細(xì)胞在5% CO2、37 ℃下培養(yǎng)24 h，加入質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染72 h。細(xì)胞消化后按1∶4密度傳代到6孔板，每孔加G418 (400 μg/mL)，每3 天更換培養(yǎng)液1次，收集陽(yáng)性細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后繼續(xù)G418篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株(pcDNA-hKIM-1-HK2)。

1.2.2 分組及缺氧培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)分3組，pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞缺氧損傷組(A組)、HK2細(xì)胞缺氧損傷組(B組，對(duì)照)、KIM-1抗體處理的pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞缺氧培養(yǎng)組(C組)。3組細(xì)胞用胰酶消化后將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/mL，分別加100 μL到96孔板中，放入1%氧濃度培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)24 h。其中C組細(xì)胞每孔加鼠抗人KIM-1單克隆抗體(100 μg/mL)1 μL。

1.2.3 ELISA法測(cè)定3組細(xì)胞KIM-1表達(dá) 取上述A、B、C組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL。取上清離心5 min，-70 ℃冷藏待測(cè)。用KIM-1 ELISA Kit 96T試劑盒按說(shuō)明操作測(cè)定3組細(xì)胞培養(yǎng)基中可溶性KIM-1表達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與吸光度值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)線的直線回歸方程式，將樣品的吸光度值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度(ng/L)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次平均值。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取3組缺氧細(xì)胞，加入20 μL MTT溶液繼續(xù)缺氧培養(yǎng)4 h，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜低速振蕩10 min。使用酶標(biāo)儀(490 nm)測(cè)定細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)以檢測(cè)的細(xì)胞活性指數(shù)表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次平均值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取3組缺氧細(xì)胞用稀釋的Binding Buffer重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整到 15×106/mL，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后室溫孵育15 min，加入5 μL(0.25 μg)的7-AAD染色液，避光室溫孵育15 min。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng)633 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)660 nm。凋亡數(shù)據(jù)以凋亡率表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次平均值。

1.2.6 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)信號(hào)分子 取3組缺氧細(xì)胞全蛋白上清液15 μL用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，一抗(分別為兔抗人ERK1/2抗體、磷酸化ERK1/2抗體、磷酸化p38 抗體、磷酸化JNK抗體、Akt抗體、磷酸化AKT抗體、兔抗人β-actin抗體)孵育90 min，二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG)孵育60 min，加入DAB 顯色液，37 ℃避光顯色。用Olympus AX70 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行積分光密度值分析，觀察A組和C組與B組相比的相對(duì)積分光密度值變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次平均值。

2 結(jié) 果

2.1ELISA法檢測(cè)細(xì)胞KIM-1表達(dá)結(jié)果 3組細(xì)胞缺氧損傷后培養(yǎng)基中可溶性KIM-1表達(dá)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。A組細(xì)胞KIM-1濃度[(130.88±23.92)ng/L]與B組細(xì)胞[(19.78±4.60)ng/L]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.681，P=0.002)，而C組細(xì)胞KIM-1濃度[(17.20±3.74)ng/L]與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.407，P=0.753)。

a:P<0.05，與B組比較。

圖1HK2細(xì)胞缺氧損傷后的可溶性KIM-1濃度檢測(cè)

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果 3組細(xì)胞缺氧損傷后細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。A組細(xì)胞活性指數(shù)(0.427±0.046)與B組(0.210±0.036)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.423，P=0.011)，而C組細(xì)胞活性指數(shù)(0.198±0.015)與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.413，P=0.720)。

a:P<0.05，與B組比較。

圖2HK2細(xì)胞缺氧損傷后的細(xì)胞活力檢測(cè)(MTT法)

2.4 流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測(cè) 3組細(xì)胞缺氧后流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示：A組細(xì)胞缺氧損傷后的早期凋亡量、晚期凋亡量及凋亡總量分別為(2.84±0.25)%、(5.29±1.27)%及(8.13±1.44)%，明顯低于B組HK2細(xì)胞(t=20.280，7.958，25.301；P=0.002，0.015，0.002)。而C組細(xì)胞凋亡量[(18.55±6.381)%、(26.84±6.651)%、(45.39±6.377%)]與B組細(xì)胞相似(t=3.851，2.807，4.725；P=0.061，0.107，0.052)。

A：參照；B：A組；C：C組；D：B組。

圖3HK2細(xì)胞缺氧損傷后的凋亡檢測(cè)(流式細(xì)胞術(shù))

2.5 凋亡相關(guān)信號(hào)分子表達(dá) 3組細(xì)胞缺氧損傷后的凋亡相關(guān)信號(hào)分子檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。3組細(xì)胞ERK、Akt及磷酸化p38，磷酸化JNK的表達(dá)量無(wú)明顯變化，而磷酸化ERK、磷酸化Akt表達(dá)在A組顯著高于B組(5.33±1.02，4.39±1.31)，且明顯高于C組(2.10±0.86，1.88±0.47)，t=12.146，17.372，P=0.012，0.015，提示KIM-1可能是通過(guò)PI3K-AKt/PKB通路和ERK通路來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。

圖4 HK2缺氧損傷的凋亡相關(guān)信號(hào)分子檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

KIM-1是最新發(fā)現(xiàn)的一種跨膜蛋白，特異性表達(dá)于損傷后的近端小管上皮細(xì)胞，因此KIM-1一直被認(rèn)為是診斷急性腎損傷的特異性標(biāo)志物[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)KIM-1是一種新的免疫球蛋白超家族上皮黏附分子，可能作為功能分子參與了細(xì)胞遷移、增殖和去分化[3-4]。Ichimura等[1]證實(shí)KIM-1是一種非骨髓來(lái)源的磷脂酰絲氨酸受體，使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為吞噬細(xì)胞，借助吞噬受體吞噬小管凋亡細(xì)胞以促進(jìn)修復(fù)。此外，可溶性KIM-1的Ig域可抑制整合素去極性化從而抑制細(xì)胞脫落并避免脫落細(xì)胞間及其與纖連蛋白間黏附，減少管型形成[1,5-6]。而且KIM-1主要表達(dá)于分裂期小管細(xì)胞并與Pax-2共表達(dá)，預(yù)示表達(dá)KIM-1的小管上皮細(xì)胞不是通過(guò)具有干細(xì)胞分化功能前體的選擇性克隆擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)修復(fù)，而是與殘存細(xì)胞的自我增殖有關(guān)[7-8]。

雖然KIM-1被確定參與了腎損傷及修復(fù)的過(guò)程，但機(jī)制尚未完全闡明。本研究發(fā)現(xiàn)KIM-1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖對(duì)抗缺氧損傷，與文獻(xiàn)報(bào)道的KIM-1與細(xì)胞增殖標(biāo)記物共陽(yáng)性吻合。本研究結(jié)果不僅說(shuō)明KIM-1是細(xì)胞增殖修復(fù)的標(biāo)志，而且是作為一種功能分子直接參與了腎小管上皮缺氧損傷后的自我修復(fù)。Bailly等[9]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF(一種已知的腎上皮細(xì)胞修復(fù)因子)在吞噬凋亡細(xì)胞的小管上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，推測(cè)KIM-1可能具有再生功能促進(jìn)損傷細(xì)胞的替代或修復(fù)。因此，雖然具體機(jī)制不清，但本研究結(jié)果結(jié)合KIM-1在去分化的近端小管上皮細(xì)胞的特異性表達(dá)以及與細(xì)胞修復(fù)因子共表達(dá)，作者認(rèn)為KIM-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)腎小管上皮表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)上皮去分化以實(shí)現(xiàn)增殖修復(fù)功能。

諸多免疫球蛋白超家族上皮細(xì)胞黏附分子除了調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞表型變化、遷移、增殖外，還具有抗凋亡作用[10]。比如T細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白-1 (TIM-1)可促進(jìn)T細(xì)胞增殖并保護(hù)T細(xì)胞免受Fas介導(dǎo)的凋亡，胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞L1樣細(xì)胞黏附分子(L1CAM)可對(duì)抗化療藥物引起的細(xì)胞凋亡、ICAM-3抑制粒細(xì)胞凋亡，ICAM-1及VCAM-1抗血管內(nèi)皮凋亡等[11-13]。另有研究發(fā)現(xiàn)：一種免疫球蛋白超家族上皮細(xì)胞黏附分子CD146可促進(jìn)血管上皮細(xì)胞增殖，其在腎小管上皮的表達(dá)可對(duì)抗缺氧損傷凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞間的同型黏附，在維持腎小管完整性和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透性等方面可能發(fā)揮著重要作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞在缺氧損傷后的凋亡量明顯低于HK2細(xì)胞，這提示KIM-1作為新的免疫球蛋白超家族上皮黏附分子同樣具有獨(dú)立的抗缺氧凋亡作用，這種作用持續(xù)存在于損傷的早期及晚期。已知真核生物的細(xì)胞凋亡在后期主要是通過(guò)caspases途徑來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，caspases家族通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)和凋亡抑制信號(hào)間的相互作用最終實(shí)現(xiàn)促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞凋亡的生存通路包括NFκB通路、PI3K-AKt/PKB通路、ERK通路[15]。本研究結(jié)果提示雖然還可能存在其他通路，但KIM-1激活PI3K-AKt/PKB通路和ERK通路抑制細(xì)胞凋亡途徑參與了缺氧損傷保護(hù)機(jī)制。

綜上所述，本研究證實(shí)了KIM-1在近端小管上皮缺氧損傷中的保護(hù)作用，結(jié)合文獻(xiàn)本研究認(rèn)為KIM-1可能通過(guò)影響近端小管上皮的表型變化，促進(jìn)細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)修復(fù)。同時(shí)，KIM-1具有獨(dú)立對(duì)抗小管上皮細(xì)胞缺氧凋亡作用，這種功能可能與促進(jìn)細(xì)胞的增殖和同型黏附，維持腎小管完整性和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透性有關(guān)。

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KIM-1 protects renal tubular epithelial cells from hypoxic injury*

HuoWenqian,ZhangKeqin△

(DepartmentofUrology,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity)

Objective To demonstrate the protective effect of Kidney injury molecule-1(KIM-1) on kidney hypoxic injury by observing the effect of KIM-1 on the proliferation and apoptosis of HK2 cells following hypoxic injury.Methods Human proximal kidney tubular epithelial cells (HK-2) were used in this study.The pcDNA-hKIM-1 plasmids were transfected into HK2 cells for obtaining pcDNA-hKIM-1-HK2 cell strain that stably expressed KIM-1.Cell viability,apoptosis and expression of apoptosis related signal molecules of pcDNA-hKIM-1-HK2(group A) and pcDNA-hKIM-1-HK2 pretreated by KIM-1 antibody(group C) were observed after hypoxic injury,and compared with the untransfected HK2(group B).Results The proliferation ability of group A was higher than the group B(0.427±0.046vs.0.210±0.036,P<0.05).The number of apoptotic cells and the apoptosis index determined by flow cytometry at early,middle and late hypoxic stages were obviously lower in the group A than in group B(P<0.05).The expression of phosphorylated ERK and phosphorylated Akt in group A increased significantly comparing with group C(P<0.05).Conclusion KIM-1 can protect renal tubular epithelial cells from hypoxic injury,and KIM-1 may suppress apoptosis through the activation of PI3K-AKt/PKB and ERK signal pathways.

kidney injury molecule-1;renal tubular epithelial cells;hypoxic injury;protective effect

第三軍醫(yī)大學(xué)青年人才創(chuàng)新基金資助(2010XQN30)。 作者簡(jiǎn)介：霍文謙(1976-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事腎缺血再灌注損傷研究?！?/p>

，Tel:13658361082；E-mail:zhkq2000@sina.com。

著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.17.002

R699.2

A

1671-8348(2015)17-2308-03

2014-10-18

2015-02-26)