利用抗性互補(bǔ)策略直接克隆染色體上大片段DNA

楊艷，朱瑩，朱美勤，韋炎龍，倪孟祥，方宏清

1.中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所 北京 100071；3.華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

Red重組廣泛應(yīng)用于基因敲除、基因突變和基因置換[1-5]，利用Red重組技術(shù)，不需要酶切連接，借助同源序列可以從細(xì)胞內(nèi)直接克隆目的DNA到質(zhì)粒載體上[6-9]。目的DNA有2類：環(huán)狀DNA，包括染色體和BAC（細(xì)菌人工染色體）質(zhì)粒；線性的外源DNA，可由基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶降解回收獲得。據(jù)此，可將重組克隆方法分為2類[7]：線性加環(huán)狀同源重組法（linear plus circular homologous re?combination，LCHR）和線性加線性同源重組法（lin?ear plus linear homologous recombination，LLHR）。

在直接克隆實(shí)驗(yàn)中，首先要設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增包含復(fù)制起始區(qū)和抗性標(biāo)記的質(zhì)粒骨架[6]，并經(jīng)酶切或其他處理，以消除殘余質(zhì)粒，避免因此而產(chǎn)生的假陽性。正向和反向引物的組成為：與基因組中目的DNA片段兩端同源的約50 bp同源臂，與質(zhì)粒骨架兩側(cè)同源的約20 bp序列。采用這種方法可以輕松地從BAC質(zhì)粒上直接克隆約30 kb的目的DNA片段，或從染色體上直接克隆3 kb的目的DNA片段。在應(yīng)用Red重組技術(shù)直接克隆染色體上的目的DNA時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)假陽性率太高。假陽性主要源于骨架自連及非靶向克隆。由于染色體DNA序列復(fù)雜度遠(yuǎn)高于BAC，當(dāng)直接克隆序列超過10 kb時(shí)，幾乎難以獲得正確的陽性克隆。

在本研究中，利用一種我們稱之為抗性互補(bǔ)的策略，提高了LCHR法重組克隆的效率。為減少非特異性重組產(chǎn)生的假陽性，設(shè)計(jì)了一種抗性互補(bǔ)策略。將p15A ori骨架上的氯霉素抗性標(biāo)記基因cat分為兩部分，即Cma、Cmb。克隆分2步進(jìn)行：第一步，在基因組靶區(qū)域一側(cè)插入一段不完整的cat基因片段Cmb和完整的卡那霉素抗性標(biāo)記基因；第二步，用電轉(zhuǎn)法將線性質(zhì)粒骨架導(dǎo)入靶細(xì)胞，該線性質(zhì)粒骨架一端包含不完整的cat基因Cma（含有部分Cmb的同源區(qū)），骨架另一端含有與基因組靶區(qū)域另一側(cè)同源的50 bp序列。借助Red同源重組，基因組上靶片段的一側(cè)Cmb與線性骨架上Cma融合形成完整的cat基因，通過氯霉素抗性篩選大大提高了陽性率。我們應(yīng)用該策略克隆了大腸桿菌DH1-Z染色體上長度為48 kb的片段，且有較高的陽性率。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中所用菌株及質(zhì)粒見表1；所有引物（表2）由上海生工生物工程公司合成。

內(nèi)切酶DpnⅠ購自NEB公司；其余酶及DNA marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒和離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA片段快速膠回收試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨（Oxoid公司）10 g/L，酵母抽提物（Oxoid公司）5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0。LB固體培養(yǎng)基須另加瓊脂粉20 g/L。蔗糖LB固體培養(yǎng)基還須另加蔗糖60 g/L，但不加NaCl。需要時(shí)，培養(yǎng)基中抗生素的濃度為：氨芐西林（Amp）100 mg/L，氯霉素（Cm）50 mg/L，卡那霉素（Kan）50 mg/L，四環(huán)素（Tet）10 mg/L。

1.2 質(zhì)粒pUC19-KanCmb的構(gòu)建

以質(zhì)粒pKD4為模板，以K-F和K-R為引物PCR擴(kuò)增約1.5 kb的Kan抗性基因片段；以質(zhì)粒p15AD2IC-SacB為模板，以ICB-F和ICB-R為引物PCR擴(kuò)增約0.6 kb的Cmb片段；再以Kan片段和Cmb片段為模板，以K-F和ICB-R為引物重疊PCR擴(kuò)增約2.1 kb的Kan-Cmb片段；后者經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后與pUC19載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂含Kan的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，次日挑取平板上長出的單菌落，以M13F和M13R為引物進(jìn)行PCR篩選，并測(cè)序驗(yàn)證，獲得陽性菌落；陽性克隆過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pUC19-KanCmb，-20℃保存。

表1 菌株及質(zhì)粒

表2 引物及序列

1.3 利用抗性互補(bǔ)法直接克隆大腸桿菌DH1-Z基因組上不同長度的DNA片段

我們擬通過克隆大腸桿菌DH1-Z基因組中35區(qū)（2344852～2350586）附近的DNA序列，驗(yàn)證抗性互補(bǔ)法的有效性。DH1-Z源自DH1，其基因組中35、36（2396224～2478151）、37（2478889～2480087）和38區(qū)（2481055～2490788）已被無痕刪除。

第一步，構(gòu)建供體質(zhì)粒p15AD2IC-35LRKCb-SacB。以DH1基因組為模板，以35-55和35-53為引物，PCR擴(kuò)增約0.5 kb的左同源臂35L，通過引物在同源臂35L的兩側(cè)引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；以35-35和35-33為引物，PCR擴(kuò)增約0.5 kb的右同源臂35R，通過引物在同源臂35R的兩側(cè)引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。將酶切片段35L（EcoRⅠ/Hind Ⅲ）、35R（BamHⅠ/XhoⅠ）、Kan-Cmb（EcoRⅠ/BamHⅠ）和酶切的p15AD2IC-SacB載體（HindⅢ/XhoⅠ）混合連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布含Kan的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，以M13F和M13R為引物PCR篩選并測(cè)序驗(yàn)證，獲得供體質(zhì)粒p15AD2-35LRKCb-SacB。

第二步，將Kan-Cmb片段整合到DH1-Z基因組的35區(qū)。將供體質(zhì)粒p15AD2-35LRKCb-SacB和輔助質(zhì)粒pAAICDGBE共轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1-Z，涂布Amp/Kan雙抗平板，30℃培養(yǎng)18～24 h，挑單菌落于1 mL含有Amp/Kan的LB培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min培養(yǎng)過夜，取50 μL菌液轉(zhuǎn)接至5 mL含有Amp的LB培養(yǎng)基中，220 r/min、30℃搖床振蕩培養(yǎng)至D600nm為 0.2～0.3，加入終濃度為 0.2%的 L-阿拉伯糖誘導(dǎo)4 h，取誘導(dǎo)后菌液稀釋至 1/10，取 0.2 mL 涂布含Kan的蔗糖平板，37℃培養(yǎng)過夜，用引物35-0和35-1進(jìn)行PCR篩選，陽性菌落條帶約3.5 kb，命名為大腸桿菌DH1-Z35LRKCb。

圖1 質(zhì)粒p15AD2IC-SacB

第三步，以AD5和AD3為引物，以BamHⅠ單酶切后的質(zhì)粒p15AD2IC-SacB為模板，PCR擴(kuò)增含有p15A ori和Cma（含Cmb的一小段同源區(qū)）的骨架AD。引物AD3包含與Cmb同源的50 bp序列；引物AD5包含50 bp與基因組擬克隆區(qū)一側(cè)互補(bǔ)的序列，克隆不同長度DNA（約2.4、10.9、48.0 kb）的引物AD5分別命名為AD5-2、AD5-10、AD5-50。約2 kb的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后用DpnⅠ酶處理徹底消除質(zhì)粒殘余。

第四步，利用骨架克隆目標(biāo)DNA。將輔助質(zhì)粒pAAGBE轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1-Z35LRKCb，挑單菌落接種至1 mL含有Amp的LB培養(yǎng)基中，30℃、220 r/m培養(yǎng)過夜，取500 μL過夜菌液接到50 mL LB培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min培養(yǎng)至D600nm為0.5～0.6，加入終濃度為0.2%的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)1 h，將菌液置于冰水浴中20 min使其冷卻，將全部菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的50 mL離心管中，4℃、6000 r/min離心10 min，棄上清，用30 mL預(yù)冷的滅菌超純水洗3次，最后用150 μL預(yù)冷的10%甘油重懸浮菌體，取50 μL菌液和5 μL骨架AD混合，加到預(yù)冷的1 mm電擊杯中，將電壓調(diào)整到1870 V后進(jìn)行電擊，而后迅速加入1 mL液體LB培養(yǎng)基混合，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，37℃、220 r/min振蕩活化1.5 h，將全部菌液涂布到含有Cm的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。若克隆到基因組上擬克隆區(qū)，Cma與Cmb互補(bǔ)重組形成完整Cm抗性基因，陽性重組質(zhì)粒能夠在Cm抗性平板上存活（圖2），而骨架自連形成的重組質(zhì)粒無Cm抗性不能在Cm平板上生長?？寺?.4、10.9 kb的 DNA片段時(shí)，直接用引物M13F/AD-1進(jìn)行PCR篩選；克隆約48 kb時(shí)，采用2對(duì)引物進(jìn)行PCR篩選，Cm一端鑒定引物為M13F/35-1，另一端鑒定引物為38-0/AD-1，捕獲過程及引物在基因組上的位置見圖3。

2 結(jié)果

圖2 抗性互補(bǔ)策略捕獲基因組上大片段DNA原理

在利用Red重組進(jìn)行LCHR法克隆基因組上的DNA片段時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)陽性率極低，尤其是當(dāng)克隆DNA片段大于10 kb時(shí)，幾乎得不到陽性克隆。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了抗性互補(bǔ)策略克隆方案（圖2）。為了驗(yàn)證該方法的有效性，首先將供體質(zhì)粒p15AD2IC-35LRKCb-SacB轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1-Z/pAAICDGBE，通過細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)I-CreⅠ內(nèi)切酶產(chǎn)生線性35LRKCb片段，在Red重組酶作用下將Kan-Cmb標(biāo)記整合到DH1-Z基因組的35區(qū)，獲得大腸桿菌DH1-Z35LRKCb，然后電轉(zhuǎn)AD片段到制備的DH1-Z35LRKCb/pAAGBE重組感受態(tài)細(xì)胞中，克隆基因組上不同長度的DNA片段。

電轉(zhuǎn)骨架AD片段到DH1-Z35LRKCb/pAAGBE細(xì)胞內(nèi)，涂Cm平板，37℃過夜培養(yǎng)后，平板上長出的單菌落數(shù)均較多（大于800個(gè)），從中隨機(jī)挑取單菌落19個(gè)到Cm液體LB中，37℃培養(yǎng)3 h后進(jìn)行菌液PCR篩選。擬克隆區(qū)約2.4、10.9 kb時(shí)，直接用引物M13F/AD-1進(jìn)行PCR篩選，陰性對(duì)照p15AD2IC約為2.0 kb。擬克隆區(qū)約48 kb時(shí)，采用2對(duì)引物進(jìn)行PCR篩選，Cm一端鑒定引物為M13F/35-1（陽性克隆PCR產(chǎn)物約3 kb），另一端鑒定引物為38-0/AD-1（陽性克隆PCR產(chǎn)物約1.5 kb），陰性對(duì)照p15AD2IC沒有條帶（圖3）。

PCR結(jié)果（圖4）顯示成功克隆到不同長度（2.4、10.9、48 kb）的基因組 DNA，陽性率分別為 100%（19/19）、79%（15/19）和 88.9%（8/9）?？寺?10.9 kb時(shí)，由于PCR鑒定時(shí)72℃延伸時(shí)間較長，故陰性對(duì)照p15AD2IC的雜帶是由非特異性擴(kuò)增所造成的。

3 討論

根據(jù)目的DNA片段來源，可將直接克隆大片段DNA的方法分為LCHR和LLHR兩類，重組后都會(huì)產(chǎn)生大量骨架自連的空載體及骨架PCR片段與其他非特異性區(qū)的重組產(chǎn)物，也含有抗性標(biāo)記，因此假陽性多，PCR篩選工作量大[6-7]。延長骨架上的同源臂長度可以增加目的片段與骨架之間的同源性，從而提高重組發(fā)生的可能性。將約50 bp的短同源臂延長至150～200 bp可以明顯提高克隆的陽性率[13]。直接克隆法可用來克隆基因組DNA片段、BAC質(zhì)粒的DNA片段和cDNA文庫中的DNA片段[7]。由于染色體結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)復(fù)雜于BAC，直接從染色體上克隆DNA序列時(shí)成功率較低，尤其是當(dāng)克隆序列超過30 kb時(shí)，幾乎難以獲得陽性克隆。基因組和BAC質(zhì)粒上的DNA可以直接用LCHR法特異性克隆目的大片段，也可以先用限制性內(nèi)切酶將基因組或BAC降解成包含目的DNA的碎片，與骨架共電轉(zhuǎn)至大腸桿菌Red/ET＋細(xì)胞中，通過LLHR法克隆目的DNA。應(yīng)用LCHR法還可以對(duì)重組后的質(zhì)粒進(jìn)行改造，如將野生型啟動(dòng)子替換為合成啟動(dòng)子、添加修飾基因等，進(jìn)一步改變重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)、表達(dá)方向和異源表達(dá)的宿主范圍等[8,14]。

圖3 捕獲不同長度基因組DNA序列流程圖

圖4 捕獲不同長度基因組DNA序列菌液PCR鑒定圖

在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)該根據(jù)擬克隆的目的DNA片段的大小不同選擇不同的載體骨架。研究發(fā)現(xiàn)，以高拷貝載體（如 pUC、pBluescript，拷貝數(shù) 500～700）和中拷貝載體（如p15A、pBR322，拷貝數(shù)15～20）為模板構(gòu)建的載體骨架克隆的大片段DNA上限為25～80 kb[15]。如果要直接克隆長達(dá)上百kb的序列，就需要使用單拷貝的BAC質(zhì)粒。BAC質(zhì)粒能夠承載200～250 kb的外源DNA序列，而且單拷貝質(zhì)粒在宿主體內(nèi)更穩(wěn)定[16]。

我們以Red重組體系介導(dǎo)的LCHR法為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了抗性互補(bǔ)拼接方案：將骨架載體上完整的抗性基因分為2部分，一部分插入基因組，一部分保留在骨架上，這2部分都無法獨(dú)立表達(dá)抗性蛋白，只有2部分發(fā)生重組拼接形成完整質(zhì)粒時(shí)才具有抗性，因此就減少了骨架自連形成的假陽。我們以中拷貝的p15A載體為骨架載體，將氯霉素抗性基因分割成Cma和Cmb，首先將具有卡那霉素抗性的融合片段Kan-Cmb插入目標(biāo)DNA的一側(cè)，通過PCR擴(kuò)增骨架，其一側(cè)含有Cma及Cmb的部分同源序列，另一側(cè)含有與目標(biāo)DNA同源的序列，然后電轉(zhuǎn)到Red重組感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行目標(biāo)DNA的克隆。應(yīng)用新的策略，我們成功地克隆了大腸桿菌DH1基因組上約2.4、10.9、48 kb的DNA片段，克隆的陽性率高于文獻(xiàn)報(bào)道水平[8,13,17]。

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