流感泰得在小鼠體內(nèi)抗H1N1型FM1株流感病毒活性研究

李慶軍，張波，夏燕平，王升啟，楊靜

1.河南中醫(yī)學院 藥學院，河南 鄭州 450008；2.軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850；

3.北京協(xié)和醫(yī)院 藥劑科，北京 100730

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，可借助空氣迅速傳播，在世界范圍多次暴發(fā)流行，嚴重威脅人類健康。甲型流感病毒根據(jù)其血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的不同，可分為16個HA亞型和9個NA亞型，它們可以通過抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)換形成新的亞型，從而引起流感大流行，例如2009年的甲型H1N1流感病毒及2013年的H7N9流感病毒，都是重組的新型流感病毒[1-3]。流感病毒抗原不斷變化導致疫苗的預防效果大大降低；同時，常用的抗流感病毒藥物均出現(xiàn)不同程度的耐藥[4-6]，使得尋找新的抗流感病毒藥物尤為迫切。反義寡核苷酸藥物因其獨特的作用機制，為病毒感染性疾病、腫瘤、心血管疾病等傳統(tǒng)藥物難以應對的疾病帶來了新的希望。自1998年首個反義核酸類藥物福米韋生上市以來，目前已有3個反義核酸藥物上市，多個核酸藥物進入臨床階段[7]。流感泰得（Flutide，F(xiàn)T）是本實驗室以流感病毒vRNA 5'端具有調(diào)控作用的保守序列為靶點設計篩選得到的一條硫代反義寡核苷酸，在體內(nèi)外對多個亞型流感病毒有抑制作用[8-10]，但對于H1N1型流感病毒FM1株的體內(nèi)抗病毒活性尚沒有文獻報道。本實驗旨在通過流感病毒感染的小鼠模型綜合評價流感泰得體內(nèi)抗H1N1型FM1株流感病毒活性。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c雄性小鼠，17～19 g，購自北京市維通利華實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001，適應性飼養(yǎng)3 d后進行相關實驗；流感病毒鼠肺適應株A/FM/1/47（H1N1）為本實驗室保存，接種于9日齡SPF級雞胚，48 h后收取雞胚尿囊液，6000 r/min離心15 min，收集上清分裝，于-70?C保存；流感泰得（堿基序列：5'-CCTTGTTTCTACT-3'，全硫代修飾，批號：20100707-4，HPLC 純度為95.9%）為本實驗制備；陽性對照藥磷酸奧司他韋來自購自豪夫邁·羅氏有限公司（批號：0709001），臨用前配置成10 mg/ml濃度；戊巴比妥鈉購自Sigma-Al?drich公司（批號：090205）；病毒RNA提取試劑盒（DP315）和Quant One Step qRT-PCR（Probe）Kit檢測試劑盒（KR113）購自北京天根有限公司；1348-2型生物安全柜購自Thermo Forma Sciencefic公司；3-18K型低溫高速離心機購自Sigma公司；CFX960型熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司。

1.2 流感泰得對流感病毒小鼠的保護實驗

實驗動物隨機分為正常對照組、病毒對照組、磷酸奧司他韋10 mg/kg組，及流感泰得2.5、5、10 mg/kg組，戊巴比妥鈉完全麻醉5 min后滴鼻給藥，24 h后再次麻醉并給藥。流感病毒于冰上解凍后，用4℃冷藏的生理鹽水稀釋為每20 μL含5倍LD50的稀釋液。第二次給藥1 h后滴鼻造模。給藥或給毒時動作應輕緩，避免小鼠噴出病毒液或藥液。攻毒后連續(xù)觀察14 d，觀察小鼠存活狀況，統(tǒng)計小鼠死亡情況和體重變化，計算平均存活天數(shù)。

1.3 肺指數(shù)的測定和肺臟病毒RNA拷貝數(shù)的測定

按上述方法分組后給藥和攻毒，于攻毒后第5 d每組隨機取出3只稱重并麻醉，取肺臟，清除殘余血液，用濾紙吸去多余的生理鹽水并稱重，按下式計算肺指數(shù)，將肺組織置于-70℃保存，用于病毒滴度檢測。

用病毒RNA試劑盒提取小鼠肺組織中的流感病毒RNA，通過熒光定量PCR檢測病毒RNA拷貝數(shù)。目標片段為M1基因，其上游引物為5'-GACC AATCCTGTCACCTCTGAC-3'，下游引物為5'-AGG GCATTATGGACAAAGCGTCTA-3'），探 針 為 5'-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3'，為本實驗室合成。反應條件：50℃ 30 min，92℃2 min，然后以92℃ 15 s、55℃ 20 s、68℃ 30 s進行40個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 流感泰得對流感病毒感染小鼠的保護作用

結(jié)果見表1。病毒對照組小鼠14 d存活率為0，流感泰得 2.5、5、10 mg/kg 組小鼠存活率分別為50%、90%和66.7%，陽性藥組存活率為77.8%，流感泰得各組均顯著提高了模型小鼠的存活率。同時，流感泰得各劑量組和陽性藥組均不同程度地減緩了病毒感染引起的小鼠體重下降，延長了小鼠存活天數(shù)（圖1、2）。病毒對照組小鼠平均存活天數(shù)為6.70 d，流感泰得 2.5、5、10 mg/kg 組小鼠存活天數(shù)為10.30、13.30和11.56 d，陽性藥組小鼠平均存活天數(shù)為12.44 d，與病毒對照組比，均具有顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 流感泰得對流感病毒感染小鼠肺指數(shù)和肺臟病毒滴度的影響

流感病毒感染可引起小鼠病毒性肺炎，從而導致肺指數(shù)升高，通常以肺指數(shù)的大小表示肺臟炎癥的嚴重程度。結(jié)果顯示（表2），與正常組相比，病毒對照組肺指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與病毒組相比，陽性藥組顯著降低了小鼠肺指數(shù)（P＜0.01）和肺臟病毒滴度（P＜0.001），流感泰得2.5、5、10 mg/kg組均顯著降低了流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)和肺臟病毒滴度（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

表1 流感泰得對流感病毒感染小鼠的死亡保護作用

圖1 流感泰得對流感病毒感染小鼠體重變化的影響

圖2 流感泰得對流感病毒感染小鼠存活率的影響

表2 流感泰得對肺指數(shù)和肺臟病毒滴度的影響

3 討論

流感是全球公共衛(wèi)生的重大威脅，近年來流感頻繁暴發(fā)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，每年北半球約1億人感染流感，造成的經(jīng)濟損失超過100億美元[11]。我國由于人口密度高、人群流動性大，也成為歷次流感暴發(fā)的重災區(qū)。所以，研制新型有效的抗流感病毒藥物具有重大的社會效益和經(jīng)濟效益。前期實驗結(jié)果表明，流感泰得對A/京防/86-1（H1N1）、A/滬防/93-9（H3N2）等多個流感病毒毒株具有抑制作用。同時，滴鼻給藥可將藥物直接送達肺部，藥代動力學結(jié)果表明滴鼻給藥時流感泰得在肺組織中的濃度比靜脈給藥更高，半衰期更長，絕對生物利用度也有很大提高[12]。

通過動物實驗探討流感泰得的抗流感病毒作用，可以從整體水平反映其抗病毒活性。本實驗中，我們用流感病毒感染的小鼠肺炎模型，以存活率、體重變化、平均存活天數(shù)、肺指數(shù)、肺臟病毒滴度為指標，研究流感泰得體內(nèi)抗H1N1型FM1株流感病毒的活性。結(jié)果顯示，與模型組相比，流感泰得各組顯著提高了小鼠存活率，對流感病毒引起的小鼠的體重下降和肺指數(shù)升高也有明顯改善；與病毒對照組相比，給藥各組肺臟病毒滴度顯著降低。這些結(jié)果顯示流感泰得具有較好的體內(nèi)抗H1N1型FM1株流感病毒活性。

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