新型小發(fā)卡RNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及抗乙型肝炎病毒應(yīng)用評(píng)價(jià)

張婷玉，張秀娟，毛瑩瑩 ，胡偉 ，王學(xué)軍，王升啟

1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA被高效特異性降解的一種基因沉默現(xiàn)象，廣泛存在于植物、線蟲(chóng)、果蠅、脊椎動(dòng)物和真菌等多種生物中[1]。引起RNAi現(xiàn)象的雙鏈RNA長(zhǎng)度約21 nt，目前主要有2種生成方式：直接化學(xué)合成的小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）和基于載體編碼的小發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）或 人 工 microRNA（artificial miRNA，amiRNA）[2]。RNAi因其高效、可沉默特異基因的特點(diǎn)而受到眾多學(xué)者的關(guān)注[3-5]。迄今，RNAi不僅作為生物基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的重要工具得到廣泛應(yīng)用，而且作為一種藥物治療的潛在形式和手段受到國(guó)內(nèi)外眾多制藥公司的青睞。

慢病毒載體是主要源于人免疫缺陷病毒1（HIV-1）的一種病毒載體，包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息[6]。慢病毒介導(dǎo)的RNAi可將目的基因整合至靶細(xì)胞基因組進(jìn)行長(zhǎng)期表達(dá)，其作用持續(xù)且穩(wěn)定，隨慢病毒的擴(kuò)散可同時(shí)擴(kuò)大載體感染細(xì)胞的范圍，適于基因治療。與普通載體相比，慢病毒載體具有攜帶基因片段容量大、轉(zhuǎn)染效率高、靶向性好、可轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞、目的基因可在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)、不易誘發(fā)宿主的免疫反應(yīng)、安全性好等諸多優(yōu)點(diǎn)[7]。

本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)明了一種基于單長(zhǎng)鏈和雙短鏈的shRNA構(gòu)建新方法[8]，但由于該shRNA表達(dá)的pshRNA-OK載體是普通載體，不能實(shí)現(xiàn)shRNA的長(zhǎng)期表達(dá)，極大地限制了其應(yīng)用范圍。為了實(shí)現(xiàn)此種shRNA的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)，我們構(gòu)建了一種用于此新型shRNA構(gòu)建、表達(dá)的慢病毒載體，并將其用于抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的效果評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

293T細(xì)胞和HepG2.CW細(xì)胞（穩(wěn)定整合1.31倍HBV中國(guó)流行株C基因型基因組序列）由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、普通PCR產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司；MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰酶、PBS購(gòu)自北京中科邁晨科技公司；慢病毒包裝系統(tǒng)（包括pCMVΔR8.2載體）由Inder M.Verma博士惠贈(zèng)；pVSV-G載體、pLNB-GB載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存（用eGFP-T2A-blasticidin骨架替換載體pLNBMP[9]中的mCherry-T2A-puromycin結(jié)構(gòu)）。

HBsAg、HBeAg診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購(gòu)自上海科華公司；HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒為深圳市普瑞康生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶和退火緩沖液2購(gòu)自NEB公司；PCR擴(kuò)增試劑盒和DNA快速連接試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑GenJet（Ver.Ⅱ）購(gòu)自SignaGen公司；殺稻瘟菌素（blastici?din）為InvivoGen公司產(chǎn)品；引物合成和質(zhì)粒測(cè)序均由中美泰和公司完成；化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 表達(dá)shRNA慢病毒載體的構(gòu)建

采用點(diǎn)突變方法將pLNB-GB載體的2個(gè)SapⅠ位點(diǎn)突變后，將用于表達(dá)shRNA的結(jié)構(gòu)（含H1啟動(dòng)子）從pshOK-basic載體中用BamHⅠ和XhoⅠ亞克隆到pLNB-GB載體，命名為pLNB-shOK-basic。用于shRNA構(gòu)建的寡核苷酸序列見(jiàn)表1。

將合成的shRNA寡核苷酸干粉用ddH2O溶解至50 μmol/L，加入退火緩沖液2，于 95℃反應(yīng)4 min、70℃反應(yīng)10 min，緩慢冷卻至室溫，形成雙鏈結(jié)構(gòu)[10]。2個(gè)和3個(gè)串聯(lián)shRNA結(jié)構(gòu)采用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，從pshOK-basic載體[8]亞克隆到pLNB-shRNAOK載體。慢病毒質(zhì)粒分別命名為neg、shRNA-3172、shRNA-139-3172、sh-RNA139-1819-3172。所有載體均經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 慢病毒的包裝

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞（DMEM培養(yǎng)基，含10%FBS）以5.0×106/皿的密度接種于10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿上，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)至80%融合，用GenJet轉(zhuǎn)染試劑將慢病毒載體三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)（shRNA慢病毒質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒pCMVΔR8.2和包膜質(zhì)粒pVSV-G）以2∶2∶1的質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，12 h后吸出轉(zhuǎn)染混合液更換新鮮培養(yǎng)液，分別于轉(zhuǎn)染后48、60、72 h收集病毒上清，混合后用0.45 μm濾膜過(guò)濾除去細(xì)胞碎片，分裝后于-70℃保存，另取10 μL用于慢病毒滴度測(cè)定。

1.4 慢病毒滴度測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞（DMEM培養(yǎng)基，含 10%FBS）以 1.0×104/孔的密度接種于 96 孔板，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)12 h，將慢病毒原液用連續(xù)稀釋法稀釋至6個(gè)梯度（10-1～10-6），終體積100 μL，棄去原培養(yǎng)液，分別加入6組細(xì)胞內(nèi)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；感染48 h后換液為新鮮培養(yǎng)基，感染60 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，以計(jì)數(shù)方式估算病毒滴度。其中以出現(xiàn)特異、呈細(xì)胞形態(tài)的熒光計(jì)為感染成功；若孔內(nèi)熒光過(guò)多無(wú)法計(jì)數(shù)，則計(jì)算低濃度慢病毒孔，直至方便計(jì)數(shù)為準(zhǔn)（一般為1～20個(gè)），即用一個(gè)孔內(nèi)計(jì)得的熒光個(gè)數(shù)×10-（n+1）（n：表示從高濃度到低濃度計(jì)數(shù)第n個(gè)孔）[11]。

1.5 慢病毒感染HepG2.CW細(xì)胞

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2.CW細(xì)胞（MEM培養(yǎng)基，含10%FBS）以1×105/孔的密度接種于24孔板，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)12 h，根據(jù)上一步慢病毒滴度測(cè)定結(jié)果，按照MOI=3（1個(gè)細(xì)胞平均感染3個(gè)病毒）將重組慢病毒感染HepG2.CW細(xì)胞，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后在熒光顯微鏡下觀察各孔綠色熒光蛋白表達(dá)情況并繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后更換含10 μg/mL殺稻瘟菌素的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選，每2 d換液；篩選至孔內(nèi)所有細(xì)胞都有綠色熒光表達(dá)時(shí)（約1周），將細(xì)胞用胰酶重新消化并計(jì)數(shù)，將不同的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞按相同密度（1×105/孔）重新鋪于24孔板中，2 d換液為新鮮培養(yǎng)基，96 h后收集上清，檢測(cè)HBsAg、HBeAg的表達(dá)和HBV DNA的含量。

表1 shRNA序列

1.6 細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg的表達(dá)和HBV DNA含量檢測(cè)

按照HBsAg、HBeAg診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）說(shuō)明書(shū)和HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。①HBsAg檢測(cè)：取75 μL細(xì)胞培養(yǎng)液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照分別加入HBsAg檢測(cè)96孔板中，37℃孵育1 h，每孔加入50 μL HBsAg的酶標(biāo)結(jié)合物，37℃孵育30 min，用洗液洗板6次，加入發(fā)光液A、B各50 μL，37℃孵育15 min，檢測(cè)D450nm值并計(jì)算相應(yīng)濃度。②HBeAg檢測(cè)：取50 μL細(xì)胞培養(yǎng)液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照分別加入HBeAg檢測(cè)96孔板中，每孔加入50 μL HBeAg的酶標(biāo)結(jié)合物，37℃孵育30 min，用洗液洗板6次，加入發(fā)光液A、B各50 μL，37℃孵育 15 min，檢測(cè) D450nm值并計(jì)算相應(yīng)濃度。③HBV DNA檢測(cè)：取100 μL樣品處理液A，分別加100 μL細(xì)胞上清液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、工作標(biāo)準(zhǔn)品1～4，振蕩混勻后13 000 r/min離心10 min（離心時(shí)固定方向），吸棄上清，各管加25 μL樣品處理液B，振蕩混勻，低速離心后100℃干浴10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清為PCR反應(yīng)模板；按照A∶B=27 μL∶0.6 μL的比例配制PCR混合液，并按27 μL/管分裝至PCR反應(yīng)管中；將處理好的樣本、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、工作標(biāo)準(zhǔn)品1～4的上清各3 μL分別加到裝有PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中，94℃ 2 min，然后以94℃ 20 s、55℃ 30 s（采集熒光信號(hào)）、72℃ 10 s行40個(gè)循環(huán)，25℃ 10 min。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±s表示，用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，假設(shè)檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒質(zhì)粒的酶切鑒定

將shRNA慢病毒質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1），可見(jiàn)4個(gè)慢病毒質(zhì)粒除了都有約10 000 bp的大條帶外，neg和shRNA-3172組小條帶約為300 bp，shRNA-139-3172組小條帶約為700 bp，shRNA-139-1819-3172組小條帶約為900 bp，與目的條帶一致。

2.2 重組慢病毒感染293T細(xì)胞的滴度估算

將慢病毒原液梯度稀釋后感染293T細(xì)胞，48 h后換液為新鮮培養(yǎng)基，60 h在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，以計(jì)數(shù)方式估算病毒滴度。圖2A為最高濃度孔（原液的10-1）的熒光圖片，圖2B示不同組別慢病毒的滴度?？梢钥闯?，載體中插入shRNA結(jié)構(gòu)會(huì)使慢病毒滴度下降，且串聯(lián)結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，慢病毒滴度越低。

2.3 重組慢病毒對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制作用

圖1 shRNA慢病毒質(zhì)粒的BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定1：neg；2：shRNA-3172；3：shRNA-139-3172；4：shRNA-139-1819-3172；M：DNA marker DL2000

圖2 shRNA串聯(lián)對(duì)慢病毒滴度的影響A：不同重組慢病毒感染293T細(xì)胞的熒光圖片；B：不同組別慢病毒的滴度；1：neg；2：shRNA-3172；3：shRNA-139-3172；4：shRNA-139-1819-3172；*P＜0.05；***P＜0.001

將重組慢病毒感染HepG2.CW細(xì)胞，用殺稻瘟菌素篩選穩(wěn)定克隆1周后以相同數(shù)量細(xì)胞（1×105/孔）分別鋪板，并于鋪板96 h取細(xì)胞上清檢測(cè)HB?sAg、HBeAg的表達(dá)水平。結(jié)果如圖3，重組慢病毒對(duì)HBsAg、HBeAg均有較好的抑制作用，shRNA-3172、shRNA-139-3172串聯(lián)、shRNA-139-1819-3172串聯(lián)組對(duì)HBsAg的抑制率分別為63.5%、74.4%、85.4%，對(duì) HBeAg的抑制率分別為 35.9%、61.3%、70.6%。在單個(gè)shRNA和2個(gè)、3個(gè)串聯(lián)結(jié)構(gòu)中，對(duì)HBsAg、HBeAg的抑制作用大小依次為：3個(gè)串聯(lián)＞2個(gè)串聯(lián)＞單個(gè)。

2.4 重組慢病毒對(duì)HBV DNA表達(dá)的影響

將重組慢病毒感染HepG2.CW細(xì)胞，用殺稻瘟菌素篩選穩(wěn)定克隆1周后以相同數(shù)量細(xì)胞（1×105/孔）分別鋪板，并于鋪板96 h取細(xì)胞上清檢測(cè)HBV DNA的水平。結(jié)果如圖4，重組慢病毒對(duì)HBV DNA的表達(dá)均有較好的抑制作用，shRNA-3172、shRNA-139-3172串聯(lián)、shRNA-139-1819-3172串聯(lián)組對(duì)HBV DNA表達(dá)的抑制率分別為65.7%、68%、79.3%。在單個(gè)shRNA和2個(gè)、3個(gè)串聯(lián)結(jié)構(gòu)中，對(duì)HBV DNA抑制作用的大小依次為：3個(gè)串聯(lián)＞2個(gè)串聯(lián)＞單個(gè)。

圖3 重組慢病毒對(duì)HBsAg（A）和HBeAg（B）的抑制作用1：neg；2：shRNA-3172；3：shRNA-139-3172；4：shRNA-139-1819-3172；*P＜0.05；***P＜0.001

圖4 重組慢病毒對(duì)HBV DNA表達(dá)的抑制作用1：neg；2：shRNA-3172；3：shRNA-139-3172；4：shRNA-139-1819-3172；**P＜0.01；***P＜0.001

3 討論

RNAi是近年發(fā)現(xiàn)的在生物體內(nèi)普遍存在的一種古老的生物學(xué)現(xiàn)象，它能夠在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)，阻斷作用高效、靶向性好[12-13]。本實(shí)驗(yàn)室在RNAi領(lǐng)域有一定基礎(chǔ)，曾利用人工miRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)實(shí)現(xiàn)了HBV[14]和登革病毒[9]的特異性抑制，并發(fā)明了一種基于單長(zhǎng)鏈和雙短鏈的shRNA構(gòu)建新方法[8]，但該shRNA表達(dá)的pshRNA-OK載體是普通載體，須通過(guò)轉(zhuǎn)染方式將shRNA導(dǎo)入細(xì)胞，因而限制了其應(yīng)用范圍。為彌補(bǔ)上述缺陷，目前通常采用病毒載體介導(dǎo)siRNA的表達(dá)。大量體外和體內(nèi)研究證明，利用腺相關(guān)病毒和慢病毒載體可提升RNAi在治療癌癥、心臟病、神經(jīng)組織退化性疾病和病毒感染性疾病方面的療效[15-19]，而且這2個(gè)病毒性載體可通過(guò)選擇不同的蛋白質(zhì)外殼或外膜產(chǎn)生組織靶向性，并可選擇組織特異性的啟動(dòng)子，從而實(shí)現(xiàn)雙重靶向。將慢病毒作為siRNA的攜帶載體，不但具備特異性地使基因表達(dá)沉默的能力，還可以充分發(fā)揮病毒載體自身所具備的優(yōu)勢(shì)，為研究基因功能提供了更強(qiáng)有力的工具[18]。另外，利用慢病毒載體包裝的策略不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類(lèi)增加，而且對(duì)基因表達(dá)的抑制效果不遜色于體外合成的siRNA，在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中可以發(fā)揮長(zhǎng)期阻斷基因表達(dá)的作用[19]。

我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)資料，全世界有超過(guò)3.5億人為慢性HBV感染，其中約1.2億人在中國(guó)，每年死于HBV相關(guān)疾病的患者高達(dá)80萬(wàn)。目前，HBV疫苗雖然可起到預(yù)防作用，但對(duì)已感染者、免疫耐受者和病毒逃逸株無(wú)效。近年來(lái)雖然研發(fā)了一些抗病毒藥物，但是存在副作用較大（干擾素）、易產(chǎn)生耐藥（核苷類(lèi)藥物）、抗原血清轉(zhuǎn)換率低等缺點(diǎn)。因此，繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)HBV感染機(jī)制的理解和相應(yīng)抗HBV藥物的研發(fā)，仍然是當(dāng)前非常重要和迫切的任務(wù)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，RNAi技術(shù)在治療乙肝感染中的潛力和優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯。2003年，Shlomai等通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RNAi技術(shù)不僅可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯階段有效抑制HBV表達(dá)，也可以抑制HBV復(fù)制；另外它的抑制作用是序列特異性的，故不受制于活躍的病毒復(fù)制[20]。本研究構(gòu)建的新型shRNA的慢病毒載體也能夠抑制HepG2.CW細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平；另外，可以通過(guò)串聯(lián)不同靶向的若干個(gè)shRNA實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)抑制，從而達(dá)到更好的抗病毒治療效果。但是，隨著串聯(lián)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度的增加，包裝慢病毒時(shí)的難度相應(yīng)增加、滴度下降，感染細(xì)胞時(shí)效率降低等問(wèn)題仍舊需要找到更好的方法克服，應(yīng)該在病毒滴度和串聯(lián)個(gè)數(shù)之間找到最佳平衡點(diǎn)。

本研究提供了一種新型shRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，并在抗HBV復(fù)制方面做了初步評(píng)價(jià)，為該shRNA慢病毒載體的進(jìn)一步應(yīng)用提供了前期依據(jù)。相信隨著RNAi應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展及研究?jī)?nèi)容的不斷加深，本研究構(gòu)建的shRNA慢病毒載體將會(huì)得到較為廣泛的應(yīng)用。

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