Cas9-sgRNA共質(zhì)粒系統(tǒng)提高在AAVS1位點的打靶效率

俞珺瑤，李曉蘭，張健萍，程濤，張孝兵

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）實驗血液學(xué)國家重點實驗室，天津 300020

CRISPR/Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌在生物進(jìn)化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，用來對抗入侵的病毒（噬菌體）及外源DNA。CRISPR/Cas系統(tǒng)通過將噬菌體和外源DNA的片段整合到CRISPR回文重復(fù)序列中，當(dāng)外源DNA再次入侵時，細(xì)胞表達(dá)的CRISPR RNA（crRNA）引導(dǎo)Cas核酸內(nèi)切酶迅速切割外源DNA，從而起到免疫防御的作用[1-3]。該系統(tǒng)主要包括3個部分[4-5]：①CRISPR相關(guān)（CRISPR-as?sociated，Cas）蛋白，包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2等；②crRNA，由一系列重復(fù)序列（direct repeats）和外源DNA來源的間隔序列（spacer）組成；③反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA），幫 助crRNA的成熟及其作用的發(fā)揮。目前在基因打靶中最常用的是Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)，該系統(tǒng)來源于嗜熱性鏈球菌，Cas9是其主要的功能蛋白，具有核酸內(nèi)切酶作用。近年來通過一系列改造，已實現(xiàn)了CRISPR/Cas9對真核細(xì)胞基因組的特異性修飾[6-8]。2013年，Mali[9]等將crRNA-tracrRNA融合為小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA），簡化了操作步驟。這種改造的sgRNA現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于基因編輯研究。

Cas9-sgRNA系統(tǒng)進(jìn)行基因打靶的原理是：Cas9-sgRNA復(fù)合物在與前間區(qū)序列鄰近基序（pro?tospacer adjacent motif，PAM）毗鄰的匹配靶DNA結(jié)合后，Cas9發(fā)生構(gòu)象改變，激發(fā)內(nèi)切酶活性，引起DNA雙鏈斷裂（double strand breaks，DSB）。在沒有導(dǎo)入包含同源重組臂的外源DNA模板的情況下，細(xì)胞將通過非同源末端連接（non-homologous-endjoining，NHEJ）的方式修復(fù)DSB[10]。這種修復(fù)方式會在缺口處隨機(jī)插入或刪除若干核苷酸，通常會導(dǎo)致移碼突變，引起基因功能的喪失。

相對于早期的鋅指核酸酶（ZFN）及類轉(zhuǎn)錄活化因子核酸酶（TALEN）來說，CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過不同的sgRNA來引導(dǎo)Cas9去識別和切割靶序列DNA[11-12]。這一基于RNA的基因定點修飾工具操作極為簡單，因此引起了科學(xué)家們的強(qiáng)烈關(guān)注。但目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)的打靶效率依然偏低，若能使這一系統(tǒng)的基因定點編輯能力大幅度提高，未來人們將可以通過修復(fù)致病基因達(dá)到治療多種疾病的目標(biāo)[13]。在此，我們試圖通過改良載體設(shè)計來提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的打靶效率。

1 材料和方法

1.1 材料

293T細(xì)胞（本室保存）；大腸桿菌Stbl3感受態(tài)、FastPfu PCR SuperMix（Transgene公司）；pSpCas9（BB）-2A-GFP、pSpCas9（BB）-2A-Puro、sgRNA AAVS1-T1和T2質(zhì)粒（Addgene公司）；限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和T4DNA連接酶（Thermo公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）（Hyclone公司）；ImPromⅡ Reverse Transcription System（Promega公司）；2×SYBR Green Mix（Roche公司）；Genomic DNA Ex?tractionKit（TaKaRa 公 司 ）；RNeasyMiniKit、RNase-FreeDNaseSet（QIAGEN 公 司）；Lipo?fectAMINE 2000（Invitrogen公司）；T7E1酶（北京泊寧樂成公司）；AAVS1 T1/T2 oligos、PCR及RT-PCR引物由Invitrogen公司合成。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

合成的AAVS1 sgRNA oligos序列信息見表1。pSpCas9-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建分3步進(jìn)行（圖1）。首先，對sgRNA oligos進(jìn)行磷酸化和退火，形成具有粘性末端的雙鏈。反應(yīng)體系：1 μL sgRNA top（100 μmol/L）+1 μL sgRNA bottom（100 μmol/L）+1 μL 10×T4DNA連接酶緩沖液+1 μL T4多核苷酸激酶（PNK）+6 μL ddH2O。反應(yīng)條件：37℃ 30 min，95℃ 5 min，再以5℃/min的速度降至25℃。然后，將 sgRNA oligos分別克隆至 pSpCas9（BB）-2AGFP、pSpCas9（BB）-2A-Puro載體[14]中。酶切及連接反應(yīng)體系：100 ng pSpCas9（BB）+2 μL sgRNA oli?gos（1∶200 稀釋）+2 μL 10×Tango緩沖液+1 μL DTT（10 mmol/L）+1 μL ATP（10 mmol/L）+1 μL FastDigest BbsⅠ+0.5 μL T4DNA連接酶，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：37℃ 5 min，21℃ 5 min，6次循環(huán)。最后，取2 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3感受態(tài)，挑取克隆測序鑒定，測序引物為U6-Fwd，序列信息參見表1。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用DMEM+10%FBS培養(yǎng)293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 d用0.25%的胰酶消化細(xì)胞并計數(shù)，取6×105細(xì)胞接種至六孔板的一個孔，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%時，用 LipofectAMINE 2000（Lipo）介導(dǎo)打靶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。分別配制質(zhì)粒和Lipo混合液（六孔板每孔）：①6 μL Lipo加至100 μL OPTI-MEM中，混勻后靜置 5 min；②3 μg pSpCas9-AAVS1 T1/2 或 1.5 μgpSpCas9、1.5 μg sgRNA AAVS1-T1/2加至 100 μL OPTI-MEM中，混勻后與Lipo混合液混合，靜置20 min。將混合液逐滴加入六孔板中，200 μL/孔，混勻。37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，6～8 h后換新鮮的DMEM/10%FBS，37℃、5%CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

表1 sgRNA oligos及T7E1 PCR、Cas9 RT-PCR引物序列信息

圖1 Cas9-sgRNA共質(zhì)粒的構(gòu)建過程AAVS1 T1/T2 oligos經(jīng)退火和磷酸化后，以雙鏈形式插入經(jīng)BbsⅠ酶切的pSpCas9上

轉(zhuǎn)染后24 h，加1 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行篩選，48 h后收取細(xì)胞；或轉(zhuǎn)染后48 h流式分選GFP+細(xì)胞，用于檢測打靶效率。

1.4 PCR擴(kuò)增及T7E1酶切分析

收取細(xì)胞后，用Genomic DNA Extraction Kit提取基因組DNA，用2×FastPfu PCR SuperMix擴(kuò)增含有NHEJ的AAVS1片段，酶、模板、引物等具體用量參照FastPfu PCR SuperMix說明書，所使用的引物為AAVS1 CEI-I Fwd/Rev，序列信息參見表1。PCR體系為20 μL，反應(yīng)條件：98℃變性10 s，62℃退火20 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)。用T7E1酶切PCR產(chǎn)物。酶切體系（20 μL）：PCR產(chǎn)物10 μL，10×緩沖液 2 μL，T7E1 酶 1 μL，ddH2O 7 μL，37℃反應(yīng) 30 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切條帶，用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，按下式計算InDel（%）：

其中a為主帶的灰度值，b和c為酶切條帶的灰度值。

1.5 RNA提取及RT-PCR

收取嘌呤霉素篩選48 h（或流式分選）后的293T細(xì)胞，用RNeasy Mini Kit提取RNA，在提取過程中用RNase-Free DNase Set處理以去除細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA，具體步驟參照RNeasy Mini kit說明書。取 1 μg RNA 用 ImPromⅡ Reverse Transcription System進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μL，具體試劑用量及步驟參照其說明書。將逆轉(zhuǎn)錄得到的20 μL cDNA稀釋至100 μL，取3 μL cDNA加ddH2O至8 μL，再與 1 μL Cas9-Fwd、1 μL Cas9-Rev、10 μL 2×SYBR Green Mix混合，得到20 μL反應(yīng)體系，按95℃ 15 s、60℃ 60 s進(jìn)行40個循環(huán)。以hGAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算Cas9的相對表達(dá)量。Cas9-Fwd和Cas9-Rev引物信息參見表1。

2 結(jié)果

2.1 對打靶效率檢測方法的簡化

檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)打靶效率的常用方法是T7E1酶切分析。其常規(guī)步驟是：PCR擴(kuò)增經(jīng)打靶后的目的DNA片段，PCR產(chǎn)物通過變性退火形成雜交雙鏈，T7E1核酸內(nèi)切酶識別堿基不配對的區(qū)域，并對該區(qū)域進(jìn)行切割。我們偶然發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物不經(jīng)變性退火，直接用T7E1酶切，對結(jié)果沒有影響。圖2顯示，是否包括變性退火步驟檢測得到的切割效率均為17%左右。我們推測，導(dǎo)致這一結(jié)果的可能原因是，在PCR后期，反應(yīng)體系中主要成分已耗盡，幾乎沒有新的PCR產(chǎn)物形成，因此合成的DNA鏈在后續(xù)循環(huán)中通過變性、退火已形成雜交雙鏈。這一發(fā)現(xiàn)對簡化T7E1分析操作步驟很有意義，在以下的研究中，我們采用這一方法檢測DNA打靶效率。

2.2 共質(zhì)粒系統(tǒng)提高打靶效率

如何提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的打靶效率，是研究人員共同關(guān)心的一個問題。在以前的報道中，通常用2種方式來表達(dá)Cas9和sgRNA，一種是用2個質(zhì)粒分別表達(dá)Cas9和sgRNA[9]，另一種方法是用一個質(zhì)粒同時表達(dá)Cas9和sgRNA[15]，但哪一種更好尚未見研究報道。我們推測，利用一個載體同時導(dǎo)入Cas9和sgRNA兩種組分可以維持它們的均衡表達(dá)，這樣可以提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的打靶效率。為驗證這一假設(shè)，我們針對AAVS1位點設(shè)計了2個sgRNA，即sgAAVS1-T1和sgAAVS1-T2，然后克隆到帶有sgRNA骨架結(jié)構(gòu)的pSpCas9質(zhì)粒上，構(gòu)建同時帶有Cas9和sgRNA兩種組分的共質(zhì)粒，并與Cas9和sgRNA分別攜帶在2個質(zhì)粒上的方式進(jìn)行了比較。我們之所以選擇AAVS1，是因為它是靶向基因治療中最常選用的“安全港”[16]。

為減少不同批次實驗誤差對結(jié)果的影響，我們計算了相對切割效率（relative InDel），其中的sgAAVS1-T2與預(yù)期結(jié)果一致，共質(zhì)粒系統(tǒng)比雙質(zhì)粒系統(tǒng)打靶效率提高80%（圖3A）。然而出乎意料的是，另一個sgRNA（sgAAVS1-T1），共質(zhì)粒系統(tǒng)沒有顯著提高打靶效率（圖3A）。我們進(jìn)一步推測，這可能是由于不同質(zhì)粒之間轉(zhuǎn)染效率不同所致。由于我們的質(zhì)粒系統(tǒng)共表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP），用流式細(xì)胞儀可以精確測定轉(zhuǎn)染效率。圖3B顯示，表達(dá)sgAAVS1-T2的一對質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率均為32%，而表達(dá)sgAAVS1-T1的一對質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率有顯著差異（33%vs 28%，P＜0.05）。這一結(jié)果可以解釋為何表達(dá)sgAAVS1-T1的共質(zhì)粒沒有提高打靶效率。sgAAVS1-T1共質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率降低的原因不明，可能與DNA的質(zhì)量偏低有關(guān)。

圖2 T7E1分析過程的簡化

我們認(rèn)為，為準(zhǔn)確測定共質(zhì)粒和雙質(zhì)粒系統(tǒng)的打靶效率，應(yīng)該去除轉(zhuǎn)染效率對結(jié)果的影響。因此，我們在轉(zhuǎn)染2 d后，用流式細(xì)胞儀分選出GFP+細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，或加嘌呤霉素篩選48 h，然后提取DNA，利用T7E1分析檢測打靶效率。結(jié)果如圖3C，對于2個不同的sgRNA，共質(zhì)粒系統(tǒng)比雙質(zhì)粒系統(tǒng)的打靶效率均提高30%～40%（P＜0.05，n=3）。綜合上述結(jié)果，我們得到結(jié)論，利用一個載體同時表達(dá)Cas9和sgRNA可以顯著提高打靶效率。

2.3 打靶效率與Cas9表達(dá)水平呈正相關(guān)

我們進(jìn)一步研究了共質(zhì)粒系統(tǒng)能夠顯著提高靶DNA切割效率的原因。我們推測，這可能和不同系統(tǒng)的Cas9表達(dá)水平有關(guān)。為此，我們收獲經(jīng)嘌呤霉素篩選48 h后的293T細(xì)胞，利用RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)Cas9的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，對于2個不同的sgRNA，共質(zhì)粒表達(dá)的Cas9 mRNA都比雙質(zhì)粒系統(tǒng)高2～3倍（圖4）。這一結(jié)果提示，共質(zhì)粒系統(tǒng)打靶效率增高的原因可能是這種載體設(shè)計方式可以提高Cas9的表達(dá)量，從而提高DNA切割效率。

3 討論

CRISPR/Cas9作為革命性的基因編輯工具，在基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究中有廣闊的應(yīng)用前景，已用于多個物種細(xì)胞的基因敲除、基因修飾等[17]。我們的研究結(jié)果對進(jìn)一步提高基因編輯效率和簡化檢測方法有一定的指導(dǎo)意義。我們發(fā)現(xiàn)，利用一個質(zhì)粒同時表達(dá)Cas9和sgRNA可以顯著提高靶DNA的切割效率，尤其是在排除轉(zhuǎn)染效率這個影響因素之后。其主要原因是這種載體設(shè)計可以使Cas9 mRNA的表達(dá)量提高2～3倍。我們還發(fā)現(xiàn)，檢測靶DNA切割效率的常用方法T7E1分析可以進(jìn)一步被簡化。在以往的T7E1檢測中，需要對目的片段進(jìn)行變性、退火，形成雜交雙鏈。而我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)過變性退火的PCR片段也能直接進(jìn)行T7E1酶切，這種PCR后直接酶切的方式并不會造成最后分析結(jié)果的偏差。使用這一簡化的方法有利于提高工作效率。

本研究中所設(shè)計的sgRNA針對人19號染色體的AAVS1位點。最初是因為發(fā)現(xiàn)在使用腺相關(guān)病毒載體（AAV）時，病毒載體很容易整合到人類第19號染色體的特異位點，所以將這個特異位點命名為AAVS1。AAVS1有蛋白表達(dá)功能，表達(dá)目前認(rèn)為無功能的P84蛋白，在該區(qū)域定點插入外源序列，不會引起隨機(jī)整合造成的原癌基因的激活，被認(rèn)為是基因打靶的“安全港”。目前已有相關(guān)研究[18-20]在人多能干細(xì)胞（hPSC）的AAVS1位點插入干擾基因表達(dá)的shRNA、參與細(xì)胞分化調(diào)控的各種因子，以及報告篩選系統(tǒng)（如Neo、GFP等）的相關(guān)序列來研究人干細(xì)胞的各種生物學(xué)功能。也有其他研究[21-22]利用該位點來表達(dá)外源功能性蛋白，如血友病FⅧ、組織型纖溶酶原激活劑（tPA）等。我們的研究結(jié)果為進(jìn)一步在AAVS1區(qū)域進(jìn)行各種功能性修飾奠定了基礎(chǔ)。

圖3 共質(zhì)粒系統(tǒng)和雙質(zhì)粒系統(tǒng)的打靶效率及轉(zhuǎn)染效率分析

圖4 Cas9 mRNA表達(dá)水平分析

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