乙型肝炎病毒對(duì)人肝癌細(xì)胞脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

顏彩玲，彭仙娥，吳云麗，林 旭，陳婉南

乙型肝炎病毒對(duì)人肝癌細(xì)胞脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

顏彩玲，彭仙娥，吳云麗，林 旭，陳婉南

目的 從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)對(duì)人肝癌細(xì)胞脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。 方法 以HBV細(xì)胞株或以1.2倍體HBV基因組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法驗(yàn)證人肝癌細(xì)胞載脂蛋白AI(apolipoprotein A-I，ApoAI)、載脂蛋白E(apolipoprotein E， ApoE)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD 2)、NADPH脫氫酶(醌)1(NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1，NQO 1)，以及肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein 1，F(xiàn)ABP 1)和乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2，ACAT 2)等脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變。結(jié)果 HBV細(xì)胞株或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV均使人肝癌細(xì)胞SOD 2、NQO 1基因的mRNA和蛋白表達(dá)量下調(diào)，F(xiàn)ABP 1基因的mRNA和蛋白表達(dá)量上調(diào)。結(jié)論 HBV可影響人肝癌細(xì)胞脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)，為HBV致肝細(xì)胞脂肪變機(jī)制的深入研究打下良好基礎(chǔ)。

乙型肝炎病毒；脂類代謝；肝細(xì)胞

近年來，乙型肝炎病毒感染與肝細(xì)胞脂肪變(hepatocellular steatosis)的關(guān)系引起了學(xué)者們的關(guān)注，并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探討[1-2]。本課題組采用雙向電泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE)分析RHBV-3細(xì)胞株(含1.2倍體HBV基因組重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞株)和RepSal-1細(xì)胞株(含對(duì)照空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞株)蛋白表達(dá)差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，HBV對(duì)HepG2細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響涉及一大類脂代謝相關(guān)蛋白的改變，包括兩種載脂蛋白：載脂蛋白AI(apolipoprotein A-I，ApoAI)、載脂蛋白E(apolipoprotein E， ApoE)，與兩種抗氧化蛋白：超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD 2)、NADPH脫氫酶(醌)1(NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1，NQO 1)表達(dá)減少；以及肝型脂肪酸結(jié)合蛋白1(fatty acid binding protein 1，F(xiàn)ABP 1)和乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2，ACAT 2)表達(dá)增高[3]。現(xiàn)有研究表明脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的異常與肝細(xì)胞脂肪變存在一定的聯(lián)系[4]。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證HBV對(duì)上述脂類相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以探討其作為HBV致肝細(xì)胞脂肪變作用機(jī)制中分子標(biāo)志物的可能性，為HBV致肝細(xì)胞脂肪變作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞 重組質(zhì)粒pRep-HBV為1.2倍體B基因型HBV基因組克隆于真核表達(dá)載體pRep10(Invitrogen公司)，對(duì)照質(zhì)粒pRepSal為pRep10質(zhì)粒去除表達(dá)盒得到；RepSal-1與RHBV-3細(xì)胞株為pRepSal與pRep-HBV質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并經(jīng)潮霉素篩選獲得，后者能穩(wěn)定表達(dá)HBV表面抗原、e抗原，分泌病毒顆粒并在細(xì)胞中持續(xù)復(fù)制[5]。以上質(zhì)粒與細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保存。肝癌細(xì)胞株Huh7、YY及HepG2購自上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清、Trizol試劑購自Invitrogen公司。實(shí)時(shí)定量PCR引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix試劑盒購自Stratagene公司。FuGENE 6 轉(zhuǎn)染試劑、CDP-Star化學(xué)發(fā)光顯色底物購自Roche公司。RIPA 蛋白裂解液(強(qiáng))和BCA蛋白定量試劑盒、牛血清白蛋白購自江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所。兔抗人-FABP 1抗體購自Abcam公司；兔抗人-ApoAI抗體、羊抗人-ACAT 2抗體、羊抗人-SOD 2抗體、鼠抗人-NQO 1抗體、鼠抗人-ApoE抗體、鼠抗人-β-tubulin抗體、驢抗羊IgG-AP、羊抗鼠IgG-AP、羊抗兔 IgG-AP均購自Santa Cruz公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞株復(fù)蘇后以含250 μg/mL Hygromycin B、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，使用前每株細(xì)胞各接種2.5×106個(gè)細(xì)胞到60 mm培養(yǎng)皿。HepG2、Huh7、YY細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前分別按6×105細(xì)胞/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，20 h后取3 μg pRep-HBV和相同分子數(shù)的pRepSal質(zhì)粒，以FuGENE 6 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，具體操作見說明書。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用Trizol試劑，將接種后48 h的RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞，或轉(zhuǎn)染后48 h的HepG2、Huh7、YY細(xì)胞提取總RNA。RNA提取過程及總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA均按試劑盒操作說明進(jìn)行。熒光定量PCR的反應(yīng)體系如下：正、負(fù)引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ROX Reference Dye 0.375 μL ，Brilliant II SYBR Green QPCR master mix 12.5 μL，模板cDNA 2 μL，加水補(bǔ)至25 μL，每份樣品、每個(gè)目的基因做3個(gè)復(fù)孔；反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃，10 min；變性95 ℃，30 s；擴(kuò)增60 ℃，1 min；共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。各目的基因?qū)崟r(shí)定量PCR引物序列見表1。對(duì)目的基因的差異表達(dá)倍數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量：每份模板、每個(gè)目的基因的3個(gè)復(fù)孔擴(kuò)增得到Ct值(熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù))，取其平均值得到一個(gè)平均Ct值；每份模板的目的基因的平均Ct值減去該模板內(nèi)參基因(GAPDH)的平均Ct值，得到ΔCt值；將HBV表達(dá)細(xì)胞(RHBV-3或pRep-HBV瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞)的ΔCt值減去對(duì)照組(RepSal-1細(xì)胞或pRepSal瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞)的ΔCt值，得到ΔΔCt值；每個(gè)目的基因在該HBV表達(dá)的模板中的平均相對(duì)含量為2-ΔΔCt，相應(yīng)對(duì)照組該值為1。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，對(duì)提取的RNA分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.2.3 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 將接種后48 h的RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞，或轉(zhuǎn)染后48 h的HepG2、Huh7、YY細(xì)胞以冰預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑PMSF)裂解細(xì)胞，獲得細(xì)胞總蛋白并使用BCA蛋白定量試劑盒定量。取等量20 μg蛋白，15% SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5% BSA封閉過夜。ApoAI抗體、ACAT2抗體、SOD2抗體、NQO1抗體、ApoE抗體分別以5% BSA作1∶200稀釋，F(xiàn)ABP1抗體以5% BSA作1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，相應(yīng)的二抗分別以5% BSA作1∶1 000稀釋，室溫孵育2 h，CDP-Star化學(xué)發(fā)光法曝光并顯影于X光膠片。β-tubulin作為內(nèi)參照。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將掃描獲得的灰度值取平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，針對(duì)同一目的基因，HBV表達(dá)細(xì)胞與對(duì)照的比較分析采用單樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析目的基因mRNA水平變化 本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中通過雙向電泳測(cè)定RHBV-3和 RepSal-1兩株細(xì)胞總蛋白質(zhì)的差異表達(dá)情況，并通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF質(zhì)譜)鑒定出50種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中包含6種脂類代謝相關(guān)蛋白：ApoAI，ApoE，SOD 2，NQO 1表達(dá)降低，F(xiàn)ABP 1和ACAT 2表達(dá)增高。本研究首先以實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證上述6種基因轉(zhuǎn)錄水平差異情況，提取1.2倍體HBV基因組穩(wěn)定表達(dá)或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以特異性引物擴(kuò)增目的基因，相對(duì)定量目的基因的差異表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖1)：與對(duì)照細(xì)胞株相比，RHBV-3細(xì)胞株中FABP1的表達(dá)量增高8.6倍，SOD 2、NQO 1及ApoE的表達(dá)量分別降低68%，60%和64%，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ApoAI和ACAT 2的表達(dá)量在RHBV-3細(xì)胞株與對(duì)照RepSal-1細(xì)胞株中的表達(dá)差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示(圖2)，與pRepSal轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染pRep-HBV質(zhì)粒的HepG2、Huh7及YY細(xì)胞中，F(xiàn)ABP 1表達(dá)量分別升高7.3倍，7.2倍，6.3倍；ACAT 2的表達(dá)量分別升高7.8倍，5.5倍，8倍；SOD 2表達(dá)量分別降低72%，60%，48%；NQO 1表達(dá)量分別降低68%，60%，67%；ApoE表達(dá)量分別降低75%，10%，33%，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ApoAI的表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

* Compared to RepSal-1 cell strains,P<0.05.

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞目的基因mRNA表達(dá)情況

Fig.1 Relative expression level of different genes in RHBV-3 and RepSal-1 cells by real-time PCR

* Compared to the cells transfected with pRepSal,P<0.05.

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞、Huh7細(xì)胞、YY細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pRep-HBV和pRepSal后目的基因mRNA表達(dá)情況

Fig.2 Relative expression level of target genes in HepG2, Huh7 and YY Cells transfected with pRep-HBV or pRepSal by Real-time PCR

2.2 Western Blot驗(yàn)證脂類代謝相關(guān)蛋白差異表達(dá) 提取RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞總蛋白，以特異性抗體Western Blot檢測(cè)上述6種蛋白的差異表達(dá)情況，條帶經(jīng)灰度掃描后，用β-tubulin的灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，分析結(jié)果顯示(圖3)，與RepSal-1細(xì)胞相比，RHBV-3細(xì)胞ApoE蛋白表達(dá)量下調(diào)66%，NQO1蛋白表達(dá)量下調(diào)35%，ApoAI蛋白表達(dá)量下調(diào)72%，SOD 2蛋白表達(dá)量下調(diào)54%，F(xiàn)ABP 1蛋白表達(dá)量上調(diào)2.14倍，ACAT 2表達(dá)變化不明顯。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pRep-HBV、pRepSal的細(xì)胞提取蛋白，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖4)：與pRepSal轉(zhuǎn)染組相比較，轉(zhuǎn)染pRep-HBV質(zhì)粒的HepG2、Huh7及YY 3株細(xì)胞中，NQO 1蛋白表達(dá)量均下調(diào)，分別下調(diào)35%，50%，45%；轉(zhuǎn)染pRep-HBV質(zhì)粒的HepG2和Huh7細(xì)胞中ApoAI蛋白表達(dá)量下調(diào)，分別下調(diào)33%和38%，但在YY細(xì)胞中的表達(dá)無明顯變化；SOD 2蛋白表達(dá)量在3株細(xì)胞均下調(diào)，分別下調(diào)36%，60%，44%；FABP 1蛋白表達(dá)量均上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)分別為2.13、1.51和1.55倍；轉(zhuǎn)染pRep-HBV質(zhì)粒的HepG2、Huh7和YY細(xì)胞中ACAT 2和ApoE蛋白表達(dá)量均無明顯變化。

* Compared to RepSal-1 cell strains,P<0.05.

圖3 Western bolt檢測(cè)RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞株ACAT 2、ApoE、NQO 1、ApoAI、SOD 2及FABP 1的表達(dá)

Fig.3 Western blot analysis of ACAT 2, ApoE, NQO 1, ApoAI, SOD 2 and FABP 1 protein expression in RHBV-3 and RepSal-1 cell lines

3 討 論

本研究在前期雙向電泳結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過1.2倍體HBV基因組的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，HBV對(duì)ApoAI、ApoE、SOD 2、NQO 1、FABP 1、ACAT 2等6個(gè)脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，在6個(gè)脂類代謝相關(guān)蛋白中，SOD 2，NQO 1和FABP 1在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的分析結(jié)果與穩(wěn)定表達(dá)HBV蛋白的肝癌細(xì)胞株獲得的分析結(jié)果完全一致，其中SOD 2、NQO 1基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)ABP 1基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)上調(diào)，變化趨勢(shì)與雙向電泳分析結(jié)果一致[5]。提示SOD 2、NQO 1、FABP 1可能是HBV致肝細(xì)胞脂肪變分子機(jī)制中重要的標(biāo)志物，其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。本研究中HBV對(duì)ApoE、ApoAI和ACAT 2共3個(gè)基因表達(dá)水平的影響，在實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果不完全一致，可能原因?yàn)檗D(zhuǎn)錄水平和蛋白水平是基因表達(dá)調(diào)控的不同層次，蛋白表達(dá)水平受更多因素的影響，如mRNA的穩(wěn)定性，翻譯效率，修飾折疊和蛋白穩(wěn)定性等因素。

氧化應(yīng)激在非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)發(fā)病機(jī)制中起重要作用[1]，SOD 2是線粒體中重要的抗氧化蛋白，是細(xì)胞內(nèi)清除反應(yīng)性氧化物(Reactive oxygen species，ROS)的主要物質(zhì)。有研究表明，NAFLD患者肝臟中的SOD活性降低、脂質(zhì)堆積，脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致丙二醛(malondialde-hyde，MDA)和4-羥基乙酸(4-hydroxyoneal，HNE)釋放，MDA和HNE通過共價(jià)鍵與蛋白結(jié)合可引起免疫性肝炎[6-7]，SOD酶活性降低的ob/ob小鼠也更易發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎[8]。NQO 1是體內(nèi)一種重要的Ⅱ相反應(yīng)酶，以NAD(P)H為受體，可將NADH或NADPH的電子傳遞給已知或未知的內(nèi)源性底物及外源性的醌類及其衍生物，發(fā)生雙電子還原反應(yīng)，生成低毒的氫醌類化合物[2]。有研究表明，與野生型小鼠相比，NQO 1基因剔除小鼠NAD(P)H在細(xì)胞內(nèi)堆積從而改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，表現(xiàn)為抑制磷酸戊糖途徑及加強(qiáng)外周組織脂肪動(dòng)員，從而導(dǎo)致其肝臟和血漿中甘油三酯含量增加，并出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象[3]，胰島素抵抗與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)[9]。FABP 1可結(jié)合脂肪酸，對(duì)脂肪酸具有攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)功能，在肝臟的脂類轉(zhuǎn)運(yùn)中扮演重要角色。有研究表明FABP 1基因剔除小鼠對(duì)脂肪酸攝入和利用能力缺陷，降低了生酮作用和脂蛋白的生成，減少了肝臟的脂肪變性[10]。在高脂飼養(yǎng)的小鼠非酒精性脂肪肝形成過程中則發(fā)現(xiàn)FABP 1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，并與肝臟脂肪變程度密切相關(guān)[11]。這些發(fā)現(xiàn)均提示，F(xiàn)ABP 1、NQO 1和SOD 2是參與肝臟脂質(zhì)代謝的重要基因，當(dāng)表達(dá)異常時(shí)可導(dǎo)致肝細(xì)胞某些功能的改變，如脂質(zhì)攝取增加、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙以及脂質(zhì)的β氧化受損，從而破壞了肝臟脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)一步導(dǎo)致各種形式脂肪肝。

本研究根據(jù)前期雙向電泳實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果，從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平進(jìn)一步證實(shí)了HBV對(duì)脂類代謝相關(guān)基因SOD 2、NQO 1、FABP 1的影響。而上述HBV對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響是由HBV編碼的表面抗原、核心抗原、e抗原及DNA聚合酶等蛋白共同作用的結(jié)果，或是由HBV中某個(gè)編碼蛋白引起的，以及其具體如何調(diào)節(jié)這些脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)，并導(dǎo)致最終的生物學(xué)效應(yīng)有待于進(jìn)一步的深入研究。

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Chen Wan-nan, Email: catherlin_2002@163.com

Effects of hepatitis B virus on lipid metabolism related proteins in human hepatoma cell lines

YAN Cai-ling,PENG Xian-e,WU Yun-li,LIN Xu,CHEN Wan-nan

(KeyLaboratoryofMinistryofEducationforGastrointestinalCancer,KeyLaboratoryofFujianProvinceforTumorMicrobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350108,China)

In this study, we aimed to investigate the effects of hepatitis B virus on lipid metabolism related proteins both in mRNA and protein levels. To address these issues, six proteins, including apolipoprotein A-I (ApoAI), apolipoprotein E (ApoE), superoxide dismutase 2 (SOD2), NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1 (NQO1), fatty acid binding protein 1 (FABP1) and acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2(ACAT2) in hepatoma cells either harboring HBV or transiently transfected with 1.2×length of HBV genome, were detected by real-time PCR or western blot analysis. Results revealed that HBV could down-regulate the expression of SOD2 and NQO1, while up-regulate the expression of FABP1, which suggested that HBV may interfere with the expression of lipid metabolism proteins, and attribute to hepatocellular steatosis.

Hepatitis B virus; lipid metabolism; hepatocytes

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81271822)；福建省教育廳科技項(xiàng)目(No. JK2009014)；福建醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金(No.2010BS004)聯(lián)合資助課題

陳婉南，Email: catherlin_2002@163.com

福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，“消化道惡性腫瘤”省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省腫瘤微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350108

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81271822), the Science Project of the Education Department of Fujian Province (No. JK2009014), and the Research Fund for the Doctoral Program of Fujian Medical University (No. 2010BS004)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.014

R373.2

A

1002-2694(2015)06-0560-05

2015-02-27；

2015-05-27