反相高效液相色譜法測(cè)定金嗓口服液中綠原酸含量

余晟嵐，徐 果

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400010； 2.中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，重慶 400042）

金嗓口服液是醫(yī)院生產(chǎn)的中成藥口服液，具有外透風(fēng)熱、內(nèi)散肺郁、清熱解毒及利咽宣聲的作用，適用于風(fēng)熱犯肺結(jié)于咽喉所致的聲音嘶啞及急慢性咽喉炎、急慢性扁桃體炎。其主要成分為金銀花、板藍(lán)根、黃芩、薄荷、玄參等中藥，在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)金銀花中的綠原酸有定性鑒別，而無有效成分的含量測(cè)定，且金銀花為主要成分。為更有效地控制質(zhì)量及提高標(biāo)準(zhǔn)，筆者采用高效液相色譜法測(cè)定該復(fù)方制劑中綠原酸的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

VARIN型雙泵高效液相色譜儀，Prostar 210UV型檢測(cè)器。綠原酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為10753-200413）；金嗓口服液（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院自制，批號(hào)分別為130113，130227，130308）；甲醇（批號(hào)為 1001743）為色譜純，磷酸（AR，批號(hào)為 110214），水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Ultimate ODS C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.5% 磷酸溶液（26 ∶74）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長：328 nm［1-5］；靈敏度：1.0 AUFS；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 500，色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品貯備液制備

稱取真空干燥的對(duì)照品綠原酸約10.50 mg，精密稱定，用50%甲醇溶解，定容至50 mL容量瓶，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取 2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，用 50% 甲醇定容后搖勻，各進(jìn)樣10 μL，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝14 324 219.73 X+974 813.5，r＝0.999 8（n＝7）。結(jié)果表明，綠原酸質(zhì)量濃度在0.010 5～0.126 0 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取質(zhì)量濃度為0.0105g／L的同一綠原酸對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣7次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD＝1.04%（n＝7），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：將同一供試品溶液放置 0，2，4，12，18，24，36 h后，分別依法各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果峰面 積 的 RSD 分 別 為 2.0% ，1.9% ，2.1% ，含 量 的 RSD 為2.31%，2.25%，2.30% （n ＝7）。表明供試品溶液在 36 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為130117）樣品5份，制備供試品溶液，照擬訂方法進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD＝1.6%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取樣品（批號(hào)分別為120815，121015，121206，130117，130227，130308）6 份各 1 mL，置 10 mL 容量瓶中，另精密加入綠原酸對(duì)照品 0.5，1.0，2.0 mL，按樣品含量測(cè)定項(xiàng)下方法分別測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 綠原酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

精密吸取樣品（先用低溫離心機(jī)以3 000 r／min的速率離心15 min）6 mL，置50 mL棕色容量瓶中，超聲處理20 min，加入50%甲醇溶液至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，精密吸取濾液4.0 mL到50 mL棕色瓶中，加50%甲醇至刻度，作為供試品溶液。依法測(cè)定5批樣品，用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝5）

3 討論

采用RP-HPLC測(cè)定金嗓口服液中綠原酸的含量，方法簡便、快速、重復(fù)性好。在色譜條件的選擇試驗(yàn)中，分別比較了0.02 mol／L的磷酸二氫鈉 -甲醇（75∶25，調(diào) pH ＝3.2）與乙腈 -0.5% 磷酸溶液（26∶74）2種流動(dòng)相，分別采用同1種ODS C18柱測(cè)定。結(jié)果以后者為流動(dòng)相時(shí)獲得良好分離［6-7］。

取對(duì)照品溶液，在200～800 nm波長范圍掃描，結(jié)果綠原酸在328 nm波長處有最大吸收，故選擇328 nm為檢測(cè)波長。

供試品溶液的制備過程中采用了2種方法。方法一：取樣品20 mL，置水浴上蒸干，加入50%甲醇熱溶，過濾，取濾液6 mL（低溫離心機(jī)以3 000 r／min離心15 min），置50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，精密吸取4 mL置50 mL棕色瓶中，加50%甲醇至刻度。方法二：精密吸取樣品（先用低溫離心機(jī)以3 000 r／min離心15 min）6 mL置50 mL棕色容量瓶中，超聲處理20 min，加入50%甲醇溶液至刻度，用0.45μm的微孔濾膜過濾，精密吸取濾液4.0 mL至50 mL棕色瓶中，加50%甲醇至刻度。測(cè)定結(jié)果顯示，方法一雜質(zhì)峰很多，相鄰峰不容易分開；而方法二相鄰峰對(duì)主峰無干擾，雜峰明顯減少，并且峰形對(duì)稱。故選擇方法二作為供試品溶液的制備方法［8-10］。

供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，24 h內(nèi)測(cè)定時(shí)峰面積一致，但隨著放置的天數(shù)增加，綠原酸峰面積有所減少。

作為院內(nèi)自制制劑，為更好地保證每一批次樣品的含量一致并提高質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，更好地為臨床用藥服務(wù)，筆者認(rèn)為，對(duì)綠原酸含量測(cè)定結(jié)果應(yīng)控制在2.0 g／L以上。

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