中藥材中黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2 測(cè)定方法研究

李 浩

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021）

黃曲霉毒素是一種對(duì)人和動(dòng)物均有極強(qiáng)毒性的劇毒物質(zhì)，世界衛(wèi)生組織（WHO）早在1993年就將其劃定為Ⅰ類(lèi)致癌物［1］，可誘發(fā)各種癌癥［2-3］，也是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的二呋喃香豆素的衍生化合物，主要由黃曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)生，目前已鑒定且明確結(jié)構(gòu)的約有 17 種成分，最常見(jiàn)的有黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2，其中黃曲霉毒素B1含量最多，且毒性和致癌性均最強(qiáng)。近年來(lái)，黃曲

霉毒素污染廣泛存在于中藥生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，故對(duì)中藥材中黃曲霉毒素含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，對(duì)于保障用藥安全有極其重要的意義［4-5］。目前，黃曲霉毒素常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜（HPLC）法、酶聯(lián)免疫化學(xué)分析法、薄層色譜法、微柱篩選法、液-質(zhì)譜聯(lián)用法等［6-11］。本研究中采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜分離-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜（HPLC-MS／MS）法測(cè)定中藥材中的黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2，以探討檢測(cè)黃曲霉毒素更好的方法。

1 儀器與試藥

安捷倫1200型高效液相色譜儀，配6410型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀配有電噴霧離子化源（ESI源，美國(guó)安捷倫公司），數(shù)據(jù)由Masshunter工作站采集和分析；AE 240型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler公司）；旋轉(zhuǎn)振蕩器（江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；Z2064型離心機(jī)（德國(guó)Hermle公司）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)；黃曲霉總量（B1，B2，G1，G2）免疫親和層析柱（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）。黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品（黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，美國(guó) Supelco 公司提供，編號(hào) Lot：LB62461）；甲醇、乙腈均為色譜純，美國(guó)J.T.Baker提供；乙酸銨為色譜純，由美國(guó)Sigma公司提供；水為高純水；藥材樣品均由本所購(gòu)買(mǎi)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Agilent XDB-C18柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為甲醇 -乙腈（3 ∶2）-0.1 mmol／L 乙酸銨，梯度洗脫條件見(jiàn)表1；流速為0.3mL／min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10μL；分析時(shí)間為10 min。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：ESI離子源；掃描方式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；噴霧器40 psi；噴霧電壓4.0 kV；干燥氣溫度350℃；干燥氣流速（N2）9 mL／min。為保護(hù)離子源，采用了分段掃描。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

表2 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2檢測(cè)離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)

2.2 測(cè)定方法

精密量取黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品0.5mL，用甲醇稀釋至10mL，制成混合對(duì)照品貯備液。精密量取貯備液1 mL，置50 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至50 mL，制成混合對(duì)照品溶液。取中藥材供試品粗粉末（約5 g），加入50 mL 70%甲醇溶液，震蕩混勻20 min，然后以2 500 r／min的速率離心5 min，精密量取5 mL上清液于25 mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋至刻度，取經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）的續(xù)濾液 20 mL，在 3 mL ／min 的流速下通過(guò)免疫親合層析柱，加入超純水20 mL分2次淋洗親和層析柱；準(zhǔn)確加入1.5 mL甲醇，分次洗脫免疫層析柱，洗脫液以超純水稀釋至2 mL，即得供試品溶液。精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS ／MS）儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，通過(guò)計(jì)算、分析后即得。

2.3 方法學(xué)考察

檢測(cè)限與定量限確定：將混合對(duì)照品溶液適當(dāng)倍比稀釋后，進(jìn)樣分析，以信噪比 S／N＝3∶1，10∶1分別確定定量限與檢測(cè)限。以黃曲霉毒素B1計(jì)，檢測(cè)限與定量限見(jiàn)表3。

表3 檢測(cè)限與定量限確定

圖 1 黃曲霉毒素 B1（A），B2（B），G1（C），G2（D）的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖及MRM總離子流圖（E）

線性關(guān)系考察：將混合對(duì)照品溶液適當(dāng)倍比稀釋后，進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積積分值，回歸分析后得相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表4。結(jié)果表明，黃曲霉毒素G2和B2進(jìn)樣量在0.3～30 pg、黃曲霉毒素G1和B1進(jìn)樣量在1～100 pg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r＞0.999 0）。

精密度試驗(yàn)：取同一混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各色譜峰的峰面積值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2的 RSD 分別為 2.95% ，4.51% ，6.25%，5.42%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

表4 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2線性關(guān)系考察結(jié)果

回收率試驗(yàn)：添加以黃曲霉毒素 B1計(jì)為 10，2，0.5 μg ／kg 的高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度溶液。取中藥供試品粗粉末5 g，各加入混合對(duì)照品貯備液（黃曲霉毒素 B1含量為 50 ng ／mL）5.00，1.00，0.25 mL，分別加70%甲醇溶液至50 mL，按擬訂方法制備供試品溶液，然后按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表5。

表 5 黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9，%）

2.4 樣品含量測(cè)定

按所建立的方法分別對(duì)生檳榔、生麥芽、炒檳榔、紅花、炒牛蒡子、川牛膝、化橘紅、柏子仁進(jìn)行了黃曲霉毒素殘留測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg／kg）

3 討論

按照免疫親和柱-HPLC法制備供試品溶液時(shí)，最后的洗脫溶劑為甲醇，直接進(jìn)樣時(shí)，峰形較差。需將供試品溶液轉(zhuǎn)化為流動(dòng)相溶解才能改善峰形。故擬將供試品溶液在50℃下用氮?dú)獯蹈?，再用流?dòng)相進(jìn)行定容。

樣品前處理方法如使用含吐溫的PBS進(jìn)行淋洗，因吐溫為表面活性劑，對(duì)質(zhì)譜的離子化效率有影響，并且污染離子源，降低儀器的靈敏度。故樣品前處理時(shí)對(duì)溶劑選擇應(yīng)加以考慮。

考慮到供試品基質(zhì)的復(fù)雜多樣性，減少雜質(zhì)對(duì)待測(cè)組分的干擾，提高方法的適用性，通過(guò)更換不同類(lèi)型色譜柱、調(diào)整流動(dòng)相等進(jìn)一步優(yōu)化色譜分離條件，能在快速分析的同時(shí)提高分離度，避免雜質(zhì)的干擾。

以目前的分析方法，黃曲霉毒素4個(gè)組分G2，G1，B2，B1的檢測(cè)限分別為 0.06，0.08，0.04，0.04 μg ／kg，靈敏度優(yōu)于 HPLC 法，已能滿(mǎn)足目前的分析需要。

由于LC-MS／MS系統(tǒng)檢測(cè)方法的通用性，可考慮目前建立的MS系統(tǒng)對(duì)其他主要真菌毒素的檢測(cè)擴(kuò)展，如赭曲霉毒素等［12］。

黃曲霉毒素的前處理方法采用的凈化方式有免疫親和柱凈化［2］、Mycosep 多功能凈化柱［3］等。LC-MS ／MS 系統(tǒng)由于其檢測(cè)方法的通用性，在同一系統(tǒng)擴(kuò)展檢測(cè)毒素種類(lèi)，則需考慮前處理方法的通用性，包括提取、凈化方式等。

HPLC-MS／MS法可適用于較復(fù)雜基質(zhì)樣品中的多組分、低含量殘留測(cè)定。與酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），氣相色譜法（GC），HPLC法等傳統(tǒng)方法比較，HPLC-MS／MS法具有速度快、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分析周期短、適用范圍廣、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［13-14］，是霉菌毒素檢測(cè)的最佳確認(rèn)方法。

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