黃芩素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的增殖抑制作用及細(xì)胞周期的影響

覃太敏，冉瑞智

（1.湖北恩施州衛(wèi)生學(xué)校，湖北 恩施 445000；2.湖北省恩施州中心醫(yī)院腫瘤科，湖北 恩施 445000）

肺癌是當(dāng)今對(duì)人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤。黃芩素（baicalein）是從唇形科植物黃芩干燥根中提取的黃酮類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多種藥理活性［1-2］。研究顯示，黃芩素對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞A431、食管癌細(xì)胞EC109等均具有抑制作用，也能降低人類骨肉瘤MG63細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［3-4］。本試驗(yàn)中研究了黃芩素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的增殖抑制作用及細(xì)胞周期的影響，并探討了其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

人肺癌細(xì)胞A549由恩施州中心醫(yī)院腫瘤研究室提供。黃芩素（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為201002，純度不低于98.0% ），用二甲基亞砜（DMSO）配制成母液，于-20℃保存；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Sigma公司）；Survivin及Caspase-3兔抗人多克隆抗體、免疫組織化學(xué)二抗試劑盒、胎牛血清、胰蛋白酶和DMSO（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；EphA2兔抗人多克隆抗體（Santa Cruz公司）；流式細(xì)胞術(shù)二抗（Jackson Immunoresearch Laboratiries Inc公司）。NAPCO CO2培養(yǎng)箱（美國 Nuair公司）；Elx酶標(biāo)儀（Bio-TEK公司）；EPICS XL流式細(xì)胞儀（美國Coulter公司）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：將人肺癌細(xì)胞A549常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素和0.1 g／L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置37℃及5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，傳代后取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

黃芩素對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用（MTT法）：將對(duì)數(shù)生長期人肺癌細(xì)胞A549用0.25%的胰蛋白酶消化后用RPMI 1640培養(yǎng)液制成1×104個(gè)／mL的細(xì)胞懸液，然后接種于96孔板，每孔100 μL，置37℃及5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液 180 μL及黃芩素20 μL。黃芩素用 DMSO溶解（DMSO終體積分?jǐn)?shù)不大于0.1%），試驗(yàn)孔分別加入黃芩素后其終質(zhì)量濃度為 1，3，10，30，100 μg ／mL，每組設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和5-氟尿嘧啶（5-FU）對(duì)照組，空白對(duì)照組加入20 μL培養(yǎng)液，5-FU對(duì)照組加入同體積5-FU（終質(zhì)量濃度為10 μg／mL）。各組分別培養(yǎng) 24，48，72 h 后，每孔加入 5 g／L MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加DMSO150μL，振蕩溶解15min，立即用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定吸光度（A）值。細(xì)胞生長抑制率＝（1-試驗(yàn)組平均 A值／空白對(duì)照組平均 A值）×100%［5］。

細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的變化（流式細(xì)胞術(shù)）：根據(jù)MTT法檢測結(jié)果，設(shè)置空白對(duì)照組及黃芩素3，10，30 μg／mL組。將對(duì)數(shù)生長期人肺癌細(xì)胞A549用0.25%的胰蛋白酶消化后，再用RPMI 1 640培養(yǎng)液制成2×104個(gè)／mL的細(xì)胞懸液，加入黃芩素培養(yǎng)24 h或48 h，用胰酶消化，收集細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，用70%乙醇懸浮細(xì)胞沉淀，于-20℃固定24 h以上。PBS離心洗去乙醇，加入PI染液，避光染色30 min，過濾后用流式細(xì)胞儀于488 nm波長處檢測DNA含量，分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期［6］。

黃芩素對(duì)EphA2，Survivin，Caspase-3表達(dá)的影響：應(yīng)用流式細(xì)胞儀，通過間接免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行蛋白含量檢測。以PBS為陰性對(duì)照，以二抗為陽性對(duì)照，用同型抗體替代抗體作為同型對(duì)照。以對(duì)數(shù)方式采集數(shù)據(jù)，以樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度表示各組蛋白的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

黃芩素質(zhì)量濃度為1～100 μg／mL時(shí)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的增殖有顯著抑制作用，且隨著質(zhì)量濃度的升高抑制作用增強(qiáng)，隨著作用時(shí)間的延長抑制作用也增強(qiáng)。詳見表1。

2.2 對(duì)細(xì)胞周期及其凋亡率的影響

黃芩素質(zhì)量濃度為3～30 μg／mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，G1／G0期DNA含量降低，S期DNA含量明顯增加。以二倍體峰（G0／G1）前出現(xiàn)亞G1峰表示凋亡細(xì)胞峰位，根據(jù)其分布組方圖計(jì)算細(xì)胞凋亡率，隨著黃芩素質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著升高。詳見表2和表3。

表1 黃芩素對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549生長的影響（ ± s，n＝6）

表1 黃芩素對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549生長的影響（ ± s，n＝6）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01。下表同。

組別 藥物質(zhì)量濃度（μg ／mL）培養(yǎng)24 h 培養(yǎng)48 h 培養(yǎng)72 h A值A(chǔ)值A(chǔ)值空白對(duì)照組5-FU組黃芩素組-10 1 3 1 0 30 100 0.184 ± 0.009 0.133 ± 0.010*0.164 ± 0.014*0.125 ± 0.009*0.086 ± 0.012*0.069 ± 0.011*0.052 ± 0.014*抑制率（%）-27.72 10.87 32.07 53.26 62.50 71.74 0.289 ± 0.013 0.204 ± 0.009*0.251 ± 0.011*0.182 ± 0.012*0.123 ± 0.008*0.095 ± 0.010*0.079 ± 0.011*抑制率（%）-29.41 13.15 37.02 57.43 67.13 72.66 0.312 ± 0.015 0.167 ± 0.009*0.235 ± 0.011*0.169 ± 0.012*0.108 ± 0.009*0.097 ± 0.011*0.075 ± 0.013*抑制率（%）-46.47 24.68 45.83 65.38 68.91 75.96

表2 黃芩素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期的影響（ ± s，n＝6）

表2 黃芩素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期的影響（ ± s，n＝6）

組別 藥物質(zhì)量濃度（μg ／mL）培養(yǎng)24 h培養(yǎng)48 h S S空白對(duì)照組黃芩素組-3 10 30 G1／G0 64.71 ± 2.12 58.32 ± 1.44*54.34 ± 1.38*47.16 ± 1.62*33.34 ± 1.43 40.36 ± 1.52*44.25 ± 1.61*51.57 ± 1.42*G2／M 1.31 ± 0.26 1.43 ± 0.33 1.52 ± 0.25 1.43 ± 0.31 G1／G0 73.62 ± 1.53 63.23 ± 1.81*55.82 ± 1.76*51.10 ± 1.60*24.82 ± 1.24*35.23 ± 1.41*42.56 ± 1.53*47.34 ± 1.67*G2／M 1.61 ± 0.32 1.54 ± 0.16 1.62 ± 0.25 1.56 ± 0.19

表3 黃芩素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡率的影響（ ± s，n＝6）

表3 黃芩素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡率的影響（ ± s，n＝6）

組別空白對(duì)照組黃芩素組藥物質(zhì)量濃度（μg／mL）-10 20 40凋亡率（%）培養(yǎng)24 h 1.23 ± 0.19 3.53 ± 0.31*6.18 ± 0.62*13.12 ± 0.74*培養(yǎng)48 h 2.23 ± 0.42 4.76 ± 0.38*9.75 ± 0.72*16.52 ± 0.72*

2.3 對(duì)細(xì)胞EphA2，Survivin，Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

質(zhì)量濃度為3～30 μg／mL時(shí)，黃芩素顯著下調(diào) EphA2和Survivin蛋白的表達(dá)，顯著上調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)。見表4。

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)顯示，肺癌發(fā)病率及病死率均居全球癌癥首位［7］。隨著我國工業(yè)化速度的加快和吸煙率的增加，肺癌的發(fā)病率在我國城鎮(zhèn)中正迅猛增長，已成為城市人口惡性腫瘤死亡的首位原因［8］。我國因癌癥死亡的患者中肺癌約占20%，且發(fā)病率及病死率均迅速增長［9］。

中藥在抗腫瘤方面有獨(dú)特的優(yōu)勢，日益受到重視。黃芩素是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的黃酮類化合物，具有多種藥理作用，已開發(fā)多種制劑而應(yīng)用于臨床。近年來的研究顯示，黃芩素在抗腫瘤方面也具有一定作用。本研究結(jié)果顯示，黃芩素質(zhì)量濃度為1～100 μg／mL時(shí)，均能顯著抑制肺癌細(xì)胞A549的生長。黃芩素抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用隨濃度的增加而增強(qiáng)，且隨作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)，故表現(xiàn)為顯著的濃度和時(shí)間依賴性。

細(xì)胞本身在一定的生理或病理?xiàng)l件下會(huì)發(fā)生凋亡，部分抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡通路有影響。有研究顯示，黃芩素可引起食管癌細(xì)胞EC109細(xì)胞周期的改變及皮膚鱗癌細(xì)胞A431的凋亡［2-3］。在本試驗(yàn)中，人肺癌細(xì)胞A549在黃芩素質(zhì)量濃度為3～30 μg／mL時(shí)，作用24 h和48 h后，采用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果表明，G1／G0期DNA含量降低，S期DNA含量明顯增加，故細(xì)胞被阻滯在S期。細(xì)胞凋亡率隨著黃芩素濃度的增加而增加。Survivin是多種腫瘤的通用抗原，高表達(dá)于所有惡性腫瘤，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和抗凋亡功能［10］。Caspase-3是Caspase家族成員中執(zhí)行凋亡的關(guān)鍵酶［6］。EphA2受體具有酪氨酸激酶活性，EphA2可高表達(dá)于多種惡性腫瘤組織［11］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著黃芩素濃度的增加，Survivin蛋白和EphA2蛋白表達(dá)減弱，而Caspase-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)。

表4 黃芩素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549 EphA2，Survivin，Caspase-3蛋白表達(dá)的影響（ ± s，n＝6）

表4 黃芩素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549 EphA2，Survivin，Caspase-3蛋白表達(dá)的影響（ ± s，n＝6）

組別 藥物質(zhì)量濃度（μg ／mL）空白對(duì)照組黃芩素組培養(yǎng)24 h培養(yǎng)48 h-3 1 0 30 EphA2 13.56 ± 1.31 9.23 ± 1.46*7.36 ± 1.52*6.24 ± 1.43*Survivin 12.65 ± 1.34 9.52 ± 1.36*7.53 ± 1.24*6.54 ± 1.58*Caspase-3 11.36 ± 1.54 16.24 ±2.53*25.46 ±3.52*34.63 ±3.24*EphA2 19.35 ± 1.59 9.75 ± 1.24*7.78 ± 0.98*6.54 ± 0.87*Survivin 18.64 ± 1.52 9.86 ± 1.74*7.83 ± 1.20*7.51 ± 1.25*Caspase-3 14.63 ± 1.52 18.52 ± 2.15*29.75 ± 2.89*37.63 ± 2.54*

黃芩素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的增殖具有一定抑制作用，其作用機(jī)制可能通過抑制Survivin蛋白和EphA2蛋白的表達(dá)，以及增強(qiáng)Caspase-3蛋白的表達(dá)，來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

參考文獻(xiàn)：

［1］Chia JH，Kenton H.Baicalein inhibits IL-1beta-and TNF-alpha-induced inflammatory cytokine production from human mast cells via regulation of the NF-kapaB pathway［J］.Clin Mol Allergy，2007，5（1）：5.

［2］伍 斌，謝紅付，李 吉，等.黃芩素抑制皮膚鱗癌細(xì)胞株A431增殖的體外研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2011，21（7）：786-792.

［3］姚懷齊，郭光華.黃芩素對(duì)食管癌EC109細(xì)胞株增殖及細(xì)胞周期的影響［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（2）：153-155.

［4］廖 于，陳 富，宴錚劍，等.黃芩素對(duì)MG63細(xì)胞侵襲浸潤能力的影響［J］.中藥藥理與臨床，2011，27（2）：32-34.

［5］朱麗麗，李惠芬.重樓皂苷對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（6）：1 501-1 502.

［6］劉 輝，左 靜，郭建文，等.格爾德霉素對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803增殖與凋亡的影響［J］.腫瘤防治研究，2010，37（6）：626-629.

［7］Herbst RS，Heymatch JV，Lippman SM.Molecular origins of cancer：lung cancel［J］.N Engl J Med，2008，359（13）：1 367-1 380.

［8］支修益，陳東紅.非小細(xì)胞肺癌外科治療現(xiàn)狀和進(jìn)展［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（3）：298-305.

［9］寧 康，王 超.肺癌早期診斷方法研究進(jìn)展［J］.山東醫(yī)藥，2010，50（21）：108-110.

［10］楊華安，茍 欣 .Survivin的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（3）：329-331.

［11］Holm R，de Putte GV，Suo Z，et al.Expressions of EphA2 and EphrinA-1 in early squamous cell cervical carcinomas and their relation to prognosis ［J］.Int J Med Sci，2008，5（3）：121-126.