反相高效液相色譜法測(cè)定去甲斑蝥素齊墩果酸復(fù)合脂質(zhì)體包封率*

方志娥 ，陳 薇 ，唐直婕 ，冷 靜

（1.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016）

去甲斑蝥素（NCTD）由馬來(lái)酐和呋喃反應(yīng)后制得的人工全合成化合物，具有較強(qiáng)的抑制肝癌等多種癌細(xì)胞生存等作用，對(duì)泌尿系統(tǒng)、胃腸道、骨髓毒副作用低［1-2］。齊墩果酸（OA）為五環(huán)三萜類天然化合物，對(duì)肝癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且呈時(shí)間和濃度依賴性［3］，還具有抗炎抗病毒等作用［4］。脂質(zhì)體是由磷脂分散在水中形成具有雙分子層的超微球狀粒子，進(jìn)入體內(nèi)后主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，具有肝靶向性，可用于治療肝腫瘤及防止淋巴系統(tǒng)腫瘤等的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。本研究中采用薄膜分散法，制備去甲斑蝥素齊墩果酸復(fù)合脂質(zhì)體，并采用冷凍超速離心-梯度洗脫反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時(shí)測(cè)定復(fù)合脂質(zhì)體中去甲斑蝥素和齊墩果酸的包封率?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀（配G1312C型二元泵，G1314F型紫外檢測(cè)器，G1329B型自動(dòng)進(jìn)樣器及Agilent Chemstation化學(xué)工作站，美國(guó)Agilent公司）；BS210S型電子分析天平（德國(guó)Sartorious公司）；KQ-3200E型超聲儀（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；Thermo Micro 21／21R型冷凍超速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；LD-50G-D型超純水處理器（重慶利迪實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。去甲斑蝥素對(duì)照品（批號(hào)為100414-200501）、齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)為110709-201206）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；去甲斑蝥素（純度98%）、齊墩果酸（純度98%）均由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供；去甲斑蝥素和齊墩果酸復(fù)合脂質(zhì)體（重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)分別為 20130319，20130325，20130329）；大豆卵磷脂（純度99%）、膽固醇（純度99%）均由成都市科龍化工試劑廠提供；甲醇（美國(guó)Teddy公司）為色譜純，Triton X-100（上海晶純實(shí)業(yè)有限公司）和其他試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)合脂質(zhì)體及溶液制備

空白脂質(zhì)體：稱取卵磷脂240 mg，膽固醇80 mg，溶于二氯甲烷30 mL中，將此溶液置250 mL圓底燒瓶中，35℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成類脂質(zhì)薄膜后，加入pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）15 mL，水合 2 h，超聲 20 min；過(guò) 0.45 μm 微孔濾膜，得空白脂質(zhì)體混懸液。取適量空白脂質(zhì)體混懸液，加入適量10%Triton X-100甲醇溶液破乳，過(guò)膜，測(cè)定。

含藥脂質(zhì)體：稱取卵磷脂240 mg，膽固醇80 mg，去甲斑蝥素20 mg，齊墩果酸10 mg，同空白脂質(zhì)體制備方法制得含藥脂質(zhì)體混懸液。取適量含藥脂質(zhì)體混懸液，加入適量10%Triton X-100甲醇溶液破乳，過(guò)膜，測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取去甲斑蝥素對(duì)照品50.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.0 g／L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，保存于4℃。準(zhǔn)確稱取齊墩果酸對(duì)照品25.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.5 g／L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，保存于4℃。

標(biāo)準(zhǔn)混合溶液：精密量取去甲斑蝥素和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，混合，用甲醇稀釋，依次配制成去甲斑蝥素質(zhì)量濃度為20，50，100，200，300 μg ／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度為 10，25，50，100，150 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，保存于4℃。

2.2 色譜條件

色譜柱：Thermo Sycronis C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm），保護(hù)柱為 Agilent Zorbax C18填料（12.5 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為純化水（磷酸調(diào)節(jié)pH至3.2），B為甲醇，梯度洗脫條件見(jiàn)表 1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：50 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：在擬訂色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)混合溶液、空白脂質(zhì)體和含藥脂質(zhì)體的色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，去甲斑蝥素約在3.7 min出峰，齊墩果酸約在8.5 min出峰，表明雜質(zhì)峰不干擾主峰，該方法專屬性強(qiáng)。

圖1 去甲斑蝥素和齊墩果酸脂質(zhì)體高效液相色圖譜

線性關(guān)系考察：按2.1項(xiàng)下方法制配去甲斑蝥素質(zhì)量濃度為20，50，100，200，300 μg ／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度為 10，25，50，100，150 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，在擬訂色譜條件下測(cè)定，以質(zhì)量濃度（C，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。回歸方程去甲斑蝥素為 A ＝2.17C+5.19（r＝0.999 8，n＝5），齊墩果酸為 A ＝22.10 C-73.49（r＝0.999 7，n＝5）。結(jié)果表明，去甲斑蝥素質(zhì)量濃度在20～300 μg／mL范圍內(nèi)［檢出限為4.5 μg／mL（S ／N ＝3）］、齊墩果酸質(zhì)量濃度在 10 ～150 μg／mL 范圍內(nèi)［檢出限為 4.0 μg／mL（S／N ＝3）］與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：按2.1項(xiàng)下方法制配去甲斑蝥素質(zhì)量濃度為20，100，300 μg ／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度為 10，50，150 μg ／mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，各連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果，去甲斑蝥素低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的 RSD≤3.25%（n＝5），齊墩果酸低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的 RSD≤3.04%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按2.1項(xiàng)下方法制配去甲斑蝥素質(zhì)量濃度為20，100，300 μg ／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度為 10，50，150 μg ／mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，于4℃保存，按擬訂色譜條件分別于1，3，5，7，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，去甲斑蝥素低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的RSD≤2.16% （n＝6），齊墩果酸低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度的RSD≤2.84%（n＝6），表明標(biāo)準(zhǔn)混合溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：按2.1項(xiàng)下方法配制去甲斑蝥素質(zhì)量濃度為20，100，300 μg ／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度為 10，50，150 μg ／mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液各5份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果去甲斑蝥素低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的 RSD≤5.89%（n＝5），齊墩果酸低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的 RSD≤4.22%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

回收率試驗(yàn)：取2.1項(xiàng)下制備的空白脂質(zhì)體，加入去甲斑蝥素和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，制備含去甲斑蝥素質(zhì)量濃度分別為20，100，300 μg／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度分別為 10，50，150 μg／mL的脂質(zhì)體。取50 μL脂質(zhì)體加入1 mL 10%Triton X-100甲醇溶液破乳。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 去甲斑蝥素和齊墩果酸的回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

2.4 脂質(zhì)體包封率測(cè)定

精密量取2.1項(xiàng)下3批含藥脂質(zhì)體（批號(hào)分別為20130319，20130325，20130329）溶液 1.0 mL，置冷凍超速離心機(jī)中，14 800 r／min 4℃離心95 min。取上清液按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算游離藥物濃度（C游）；同時(shí)將離心前的脂質(zhì)體混懸液用10%Triton X-100甲醇溶液破乳并稀釋至適當(dāng)倍數(shù)測(cè)定，計(jì)算出藥物總濃度（C總），按以下公式計(jì)算藥物包封率：包封率（%）＝（C總-C游）／C總×100%。結(jié)果脂質(zhì)體中去甲斑蝥素的平均包封率為（48.01±2.34）% （n＝5），齊墩果酸的平均包封率為（87.31 ± 0.56）% （n ＝ 5）。

3 討論

脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法的確定：測(cè)定脂質(zhì)體包封率的常用方法有透析法［5］、葡聚糖凝膠柱色譜法［6］、魚精蛋白凝聚法［7］、離心法［8］等。透析法簡(jiǎn)單，不需昂貴的儀器，但耗時(shí)較長(zhǎng)。葡聚糖凝膠柱色譜法分離脂質(zhì)體和游離藥物時(shí)洗脫液對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行了大量稀釋，可能導(dǎo)致脂質(zhì)體滲漏。魚精蛋白凝聚法的測(cè)定結(jié)果受脂質(zhì)體Zeta電位影響。超速離心法對(duì)離心機(jī)要求較高，但操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，可有效分離脂質(zhì)體和游離藥物。因此，選用超速離心法測(cè)定脂質(zhì)體包封率。

高效液相色譜（HPLC）法的確定：去甲斑蝥素和齊墩果酸的結(jié)構(gòu)相差較大，在色譜柱中的保留行為有差異。以標(biāo)準(zhǔn)混合溶液試驗(yàn)了等度和梯度2種洗脫方式。考察了流動(dòng)相組成水（磷酸調(diào)節(jié) pH 至 3.2）∶甲醇（V ／V）為 65 ∶35，45 ∶55，25 ∶75，5 ∶95 時(shí)等度洗脫去甲斑蝥素和齊墩果酸的分離情況。結(jié)果表明，去甲斑蝥素和齊墩果酸色譜峰的出峰時(shí)間隨流動(dòng)相中有機(jī)相含量的增加而逐漸減小，由于齊墩果酸的脂溶性較強(qiáng)，只有在高比例的有機(jī)相條件下出峰較快，同時(shí)去甲斑蝥素色譜峰和溶劑峰不能完全分離，故考慮使用梯度洗脫使2種物質(zhì)得到最佳分離并縮短分析時(shí)間。經(jīng)過(guò)考察，梯度洗脫條件：0～3 min，水（磷酸調(diào)節(jié)pH至3.2）∶甲醇（V ／V）為 65 ∶35，流速為 1.0 mL ／min；3 ～3.5 min，水（磷酸調(diào)節(jié) pH 至 3.2）-甲醇（V ／V）為65∶35→5∶95，流速為 1.0 mL ／min；3.5 ～4.5 min，水（磷酸調(diào)節(jié) pH 至 3.2）∶甲醇（V ／V）為 5 ∶95，流速為 1.0→1.7 mL／min；4.5 ～10 min，水（磷酸調(diào)節(jié) pH 值至 3.2）∶甲醇（V ／V）為 5 ∶95，流速為 1.7 mL ／min。此時(shí)，去甲斑蝥素和齊墩果酸得到最佳分離且分析時(shí)間大大縮短。

參考文獻(xiàn)：

［1］李功權(quán)，張水軍，呂建鋒，等.去甲斑蝥素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)觀察［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90（30）：2 145-2 148.

［2］Sun ZX，Ma QW，Zhao TD，et al.Apoptosis Induced by Norcantharidin In Human Tumor Cells［J］.World J Gastroentero，2000，6（2）：263-265.

［3］吳英俊，王超男，劉潔婷，等.蛇莓中齊墩果酸對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721 的抑制作用［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2011，32（4）：306-308.

［4］王曉峰，李繼堯，于繼人.齊墩果酸對(duì)肝損傷小鼠血清及肝細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)氨酶作用的研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，1999，34（6）：377-379.

［5］熊 非，朱家璧，王 維，等.燈盞花素納米脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39（9）：755-757.

［6］張 蓓，王東凱，宋 揚(yáng)，等.細(xì)辛腦脂質(zhì)體的制備及包封率的測(cè)定 ［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，32（1）：67-68.

［7］孫維彤，黃桂華，葉杰勝，等.魚精蛋白凝聚法測(cè)定脂質(zhì)體和納米脂質(zhì)體包封率［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，41（22）：1 716-1 720.

［8］陸偉根，陳亭亭，任德權(quán).草烏甲素多囊脂質(zhì)體包封率的測(cè)定［J］.中成藥，2007，29（6）：825-827.