摘要:目的 建立芪葛顆粒中葛根素含量測定方法。方法 采用高效液相色譜法,PhenomenexLuna5uC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),流動相為甲醇-水(25:75),流速1.0ml·min-1,柱溫30℃,檢測波長為250nm。結(jié)果 葛根素在16.88~270.00μg/ml,呈良好的線性關(guān)系(r=0.9998),定量限為6.78ng·ml-1,回收率為96.5%,RSD為1.0%(n=9)。結(jié)論 本方法快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性良好,可作為芪葛顆粒質(zhì)量分析控制方法。
關(guān)鍵詞:芪葛顆粒;葛根素;高效液相色譜
芪葛顆粒由黃芪、葛根、桂枝、威靈仙等8味中藥經(jīng)提取精制而成,具有溫經(jīng)活血,疏風(fēng)散寒,宣痹通絡(luò)的功效,用于神經(jīng)根型頸椎病風(fēng)寒阻絡(luò)證引起的頸項(xiàng)強(qiáng)痛、肩背疼痛、頸項(xiàng)活動不利、肢體麻木、畏寒肢冷、四肢拘急等癥[1]。葛根為方中君藥,且用量最大,為加強(qiáng)本品內(nèi)在質(zhì)量控制,在原有黃芪甲苷含量測定的基礎(chǔ)上[1],增加葛根中葛根素的含量測定,同時對方法中供試品制備的提取溶劑、提取方法、提取時間、提取溶劑用量均進(jìn)行了考察,制定了本品中的葛根素含量測定方法。
1儀器與試藥
1.1儀器 Agilent1200高效液相色譜儀,G1315DDAD二極管陣列檢測器,所用軟件為ChemStation色譜工作站。Milli-QAdvantageA10超純水機(jī),SatoriusME5電子分析天平,KQ-250DV超聲波清洗儀,電熱恒溫水浴鍋。
1.2試藥 芪葛顆粒(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司,規(guī)格為10g/袋,批號120201、120301、120501、120601、120602、120901、121001、130101);葛根素對照品,購自中國食品藥品檢定研究院(供含量測定用,批號為110752-200912);甲醇(色譜純,美國天地公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。
2色譜條件
色譜柱:PhenomenexLuna5uC18(250mm×4.6mm,5μm);流動相:甲醇-水(25:75);流速:1.0ml·min-1;檢測波長:250nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:5μl。理論板數(shù)按葛根素峰計算不低于4000,見圖1。
圖1 葛根素對照品(A)、芪葛顆粒樣品(B)及芪葛顆粒陰性樣品(C)HPLC色譜圖
3提取方法的考察
采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取方法,考察提取溶劑A、提取時間B、提取方法C及溶劑用量D,4個因素對提取結(jié)果的影響。因素水平見表1。L9(34)正交表設(shè)計及結(jié)果見表2。
從極差R值可以看出,影響提取的因素:提取溶劑A>提取方法C>提取時間B>溶劑用量D;各因素的最有水平組合為A1C2B1D2。對上述結(jié)果進(jìn)行方差分析見表3,從方差分析結(jié)果可以看出,影響因素提取溶劑A最具有顯著性,影響因素順序?yàn)椋禾崛∪軇〢>提取方法C>提取時間B>溶劑用量D;各因素最優(yōu)水平組合為A1C2B1D2,與直觀分析結(jié)果一致。最終確定提取方案為:50ml的30%乙醇,回流提取30min。
4溶液的制備
4.1對照品溶液的制備 取葛根素對照品適量,精密稱定,加30%乙醇制成每1ml含80μg的溶液,即得。
4.2供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品,研細(xì),取約0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入30%乙醇50ml,稱定重量,加熱回流30min,放冷,再稱定重量,用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
5線性關(guān)系考察
精密稱取葛根素對照品適量,制得一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液(濃度為270μg/ml)。將儲備液分別稀釋成濃度為16.88μg/ml、33.75μg/ml、67.50μg/ml、135.00μg/ml、270.00μg/ml的溶液,分別進(jìn)樣5μl,以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為Y=21.005X+6.7597,r=0.9998結(jié)果表明葛根素在16.88μg/ml~270.00μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。按信噪比(S/N)為10:1計算,葛根素的定量限為6.78ng/ml。
6精密度試驗(yàn)
精密吸取葛根素對照品溶液5μl,重復(fù)進(jìn)樣6次,以峰面積計算RSD值為0.39%,結(jié)果表明該方法精密度良好。
7重復(fù)性試驗(yàn)
取同一供試品(批號為120601),按4.2制備供試品溶液,平行制備6份,測定,結(jié)果葛根素的平均含量為91.2mg/袋,RSD=1.7%,結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。
8中間精密度試驗(yàn)
取同一供試品(批號為120601),按4.2制備供試品溶液,由兩位分析人員于不同時間分別制備6份供試品并分別使用兩臺儀器測定,計算RSD值為1.9%,結(jié)果表明該方法中間精密度良好。
9穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一供試品(批號為120601),按4.2制備供試品溶液,分別在第0、1、2、4、6、8、12、16h進(jìn)行測定,計算峰面積RSD為0.2%,結(jié)果表明供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定良好。
10回收率試驗(yàn)
取已知含量的樣品(批號120601,葛根素含量:91.2mg/袋)九份,每份0.5g,分別按80%、100%和120%加入對照品,按4.2制備供試品溶液,分別精密吸取5?L,注入液相色譜儀,測定,計算加樣回收率,見表4。
11樣品測定
取7批樣品,按3.2制備供試品溶液,分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各5μl,注入高效液相色譜儀,測定,計算,見表5。
12討論
12.1色譜條件耐用性考察 本文對不同品牌色譜柱、不同柱溫和不同流動相比例進(jìn)行了考察,結(jié)果表明本文采用的色譜條件耐用性良好。
12.2測定波長的選擇及色譜峰純度驗(yàn)證 根據(jù)葛根素的全波長紫外吸收光譜及文獻(xiàn)[2~4],選擇250nm做為葛根素測定波長,經(jīng)試驗(yàn)在此波長下,供試品色譜中葛根素峰與其它雜質(zhì)峰達(dá)到很好的分離,陰性樣品無干擾。使用二極管陣列檢測器,對葛根素對照品色譜和供試品色譜中的葛根素吸收峰,分別讀取了190~370nm的紫外吸收光譜。經(jīng)對二者的紫外吸收光譜進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)紫外吸收光譜相似度達(dá)到97%。
12.3芪葛顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚無對葛根素含量測定的方法,本實(shí)驗(yàn)建立的方法操作簡單、快速,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,可作為芪葛顆粒質(zhì)量控制依據(jù)。
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編輯/申磊