5—氮雜—2'—脫氧胞嘧啶核苷對(duì)腫瘤細(xì)胞化療敏感性的作用研究

目前，許多腫瘤常規(guī)化療效果差，預(yù)后不良是困擾臨床的重要難題，而腫瘤多藥耐藥性（MDR）則是腫瘤化療失敗的關(guān)鍵因素。經(jīng)治療后，殘存的腫瘤干細(xì)胞耐藥性形成，常導(dǎo)致對(duì)某些藥物治療敏感性降低，并引起腫瘤復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移，因此MDR已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)[1]。

國(guó)內(nèi)外均有大量文獻(xiàn)表明5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷能增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，即降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性[2]。雖然早期應(yīng)用于血液病，但在實(shí)體腫瘤中也有不同的作用機(jī)制來(lái)增強(qiáng)傳統(tǒng)化療藥物的敏感性，為臨床上對(duì)抗腫瘤多藥耐藥提供了新的思路。

1 5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷（地西他濱）的發(fā)展歷史

5-氮雜胞苷、5-氮雜-2'脫氧胞苷（地西他濱）最廣泛的應(yīng)用于DNA的去甲基化。在體內(nèi)外，脫甲基作用導(dǎo)致遺傳學(xué)上沉默的腫瘤抑制因子慣序地激活。盡管地西他濱作有抗白血病的作用被發(fā)現(xiàn)已有40年歷史，它在惡性血液病的治療潛力僅僅最近才被批準(zhǔn)用于高風(fēng)險(xiǎn)的骨髓增生異常綜合征以及作為年齡>65歲、非加強(qiáng)化療的急性髓性白血病患者的一線(xiàn)用藥。一些臨床試驗(yàn)顯示小劑量地西他濱在治療慢性粒細(xì)胞白血病和血紅蛋白病也有潛力，然而對(duì)實(shí)體腫瘤的療效有限。臨床反應(yīng)似乎在表觀遺傳學(xué)、細(xì)胞周期阻滯和/或細(xì)胞凋亡都有表現(xiàn)。最近的和進(jìn)行中的臨床試驗(yàn)探討新的給藥方案、給藥途徑以及地西他濱與其他藥物的配伍，這些藥物包括組蛋白脫乙酰酶抑制劑[3]。

2 5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷（地西他濱）作用機(jī)制

5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-cdR）即地西他濱（decitabine）是一種天然的脫氧胞苷酸的腺苷類(lèi)似物。在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)磷酸化后與腫瘤內(nèi)的胞嘧啶競(jìng)爭(zhēng)，以共價(jià)鍵與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，使DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶失活，阻斷細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)小劑量的地西他濱對(duì)腫瘤的治療有效，相對(duì)的實(shí)驗(yàn)室研究認(rèn)為小地西他濱使DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶失活，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化[4]。

目前腫瘤的耐藥性是臨床上的難題，也是腫瘤患者預(yù)后不良的一個(gè)重要因素[5]。在遺傳學(xué)上，存在基因改變。而在表觀遺傳學(xué)上，DNA序列沒(méi)有改變，只是基因被甲基化修飾，抑制基因的表達(dá)[6]。在哺乳動(dòng)物基因組中，胞嘧啶含量?jī)H為1%。這是因?yàn)榘奏と菀妆患谆蔀?-甲基胞嘧啶。當(dāng)癌基因低甲基化、抑癌基因高甲基化時(shí)，癌基因過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[7]。已有大量文獻(xiàn)表明5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷能增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，即降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，現(xiàn)大致綜述如下。

2.1肝癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。目前沒(méi)有有效地藥物干預(yù)能治療肝癌[8]。大多數(shù)惡性腫瘤表現(xiàn)出異?；騿?dòng)子區(qū)域的甲基化導(dǎo)致基因功能的喪失[9]。去甲基化試劑5-Aza-CdR可以重新激活MAT1A基因表達(dá)和抑制MAT2A基因表達(dá)，誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞生成相同的產(chǎn)物，扭轉(zhuǎn)MAT1A啟動(dòng)子的甲基化，從而它抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究結(jié)果可以提供一個(gè)機(jī)制，通過(guò)5-Aza-CdR對(duì)肝癌細(xì)胞發(fā)揮持續(xù)增長(zhǎng)的抑制作用[10]。在肝癌細(xì)胞中，丟失了表觀遺傳學(xué)修飾的癌細(xì)胞對(duì)放化療缺乏應(yīng)答。甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶1A在肝癌細(xì)胞中是滅活的，它的滅活可能是基因的表觀遺傳學(xué)改變，這些改變中包括啟動(dòng)子甲基化。因此，藥物解放表觀遺傳學(xué)的抑制作用可能逆轉(zhuǎn)這個(gè)過(guò)程[11]。Liu，W.J研究了去甲基化試劑5-氮雜-2'脫氧胞苷在肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞系中對(duì)MAT1A基因表達(dá)、DNA甲基化和腺苷甲硫氨酸產(chǎn)生的影響。我們發(fā)現(xiàn)在經(jīng)5-氮雜-2'脫氧胞苷干預(yù)的肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞系中，MAT1A mRNA和蛋白的表達(dá)激活，啟動(dòng)子甲基化也逆轉(zhuǎn)了。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-氮雜-2'脫氧胞苷處理后的肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞系中，MAT2A mRNA和蛋白的表達(dá)顯著減少，腺苷甲硫氨酸產(chǎn)物也顯著減少。然而，5-氮雜-2'脫氧胞苷對(duì)MAT2A甲基化沒(méi)有作用。此外，5-氮雜-2'脫氧胞苷通過(guò)下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax、caspase-3來(lái)抑制肝癌Huh7細(xì)胞系的增殖、誘導(dǎo)凋亡。我們的觀察值顯示5-氮雜-2'脫氧胞苷在肝癌Huh7細(xì)胞系中通過(guò)改變基因的表觀遺傳增加甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶1A的表達(dá)以及誘導(dǎo)活性腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)生發(fā)揮了抗腫瘤作用[12]。

2.2有前期的實(shí)驗(yàn)室和臨床數(shù)據(jù)顯示使DNA去甲基化的藥物有潛在地減少鉑抵抗型卵巢癌的發(fā)展[13]。為此，Glasspool，R.M測(cè)試了DNA低甲基化試劑5-氮雜-2'脫氧胞苷（地西他濱）可逆轉(zhuǎn)卡鉑抵抗的復(fù)發(fā)性卵巢癌的女患者這個(gè)假說(shuō)。在卵巢癌中，mir-130b基因表達(dá)水平的下調(diào)與臨床分期達(dá)到III-IV期和組織學(xué)分化較差的腫瘤有關(guān)。mir-130b的表達(dá)能夠抑制多藥耐藥卵巢癌細(xì)胞?；謴?fù)mir-130b的表達(dá)可以使抗癌藥物敏感性增強(qiáng)。目前的研究發(fā)現(xiàn)mir-130b基因甲基化水平與卵巢癌組織以及耐藥細(xì)胞系負(fù)相關(guān)的表達(dá)式。脫甲基的5-aza-CdR導(dǎo)致激活mir-130b在耐藥卵巢癌細(xì)胞株的表達(dá)，從而增加順鉑和紫杉醇的感性。在這個(gè)化療計(jì)劃中，在部分鉑抵制的卵巢癌患者添加地西他濱是降低還是增加卡鉑化療的有效性很難區(qū)分。在未來(lái)的聯(lián)合用藥研究中，患者的選擇，不同的化療方案或者不同的去甲基化試劑都需要考慮進(jìn)來(lái)[14]。

2.3橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤是兒童最常見(jiàn)的肉瘤[15]。盡管使用標(biāo)準(zhǔn)的療法，將近有1/3的尤因氏肉瘤的患者復(fù)發(fā)，并且復(fù)發(fā)后有治療潛力的藥物極其有限。免疫療法是一種有潛力的治療方法[16]。它以腫瘤特異抗原為靶，保留正常細(xì)胞。已經(jīng)有文獻(xiàn)[17]證實(shí)去甲基化試劑5-氮雜-2'脫氧胞苷（地西他濱）可以上調(diào)睪丸癌抗原、人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體分子、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞粘附分子-1在兒童肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果加強(qiáng)了兒科骨肉瘤患者睪丸癌抗原特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。按藥理學(xué)劑量水平的地西他濱處理骨肉瘤細(xì)胞系后，在mRNA水平也有重要的表達(dá)增加，MAGE-A1和MAGE-A3達(dá)到70%，NY-ESO-1達(dá)到80%。在停止地西他濱干預(yù)>30 d后，在肉瘤細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤細(xì)胞系MAGE-A1、MAGE-A3、NY-ESO-1依然維持高表達(dá)。此外，在用地西他濱研究過(guò)的9個(gè)細(xì)胞系中，有7個(gè)誘導(dǎo)上調(diào)MAGE-A1、MAGE-A3、NY-ESO-1蛋白的表達(dá)。這些研究表明在治療兒科骨肉瘤時(shí)，可聯(lián)合使用去甲基化試劑和睪丸癌抗原誘導(dǎo)的免疫療法[18]。

2.4對(duì)于進(jìn)展期的前列腺癌去雄激素治療是最基本的治療方案。然而，通過(guò)最初的回歸分析，大多數(shù)患者不可避免的發(fā)展成致命的非雄激素依賴(lài)型腫瘤[19]。因此，弄清楚非雄激素依賴(lài)型前列腺癌的轉(zhuǎn)變機(jī)制對(duì)治療不能進(jìn)行傳統(tǒng)化療的老患者確定新的治療方案是很要緊的。[20]Wang-X驗(yàn)證了在LNCaP和PC3了兩種細(xì)胞系中，5-氮雜-2'脫氧胞苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并增加miR-146a的表達(dá)。miR-146a的表達(dá)在LNCaP細(xì)胞系比PC3細(xì)胞系中更高。在5-氮雜-2'脫氧胞苷處理的細(xì)胞中MiR-146a抑制劑抑制了細(xì)胞凋亡。在移植了LNCaP細(xì)胞系的閹割鼠模型中，5-氮雜-2'脫氧胞苷顯著地抑制了腫瘤生長(zhǎng)，也抑制了前列腺癌的進(jìn)展。同時(shí)，在經(jīng)過(guò)5-氮雜-2'脫氧胞苷處理的移植鼠皮下的雄激素依賴(lài)型腫瘤中，MiR-146a表達(dá)也顯著地增強(qiáng)，而在非雄激素依賴(lài)的閹割鼠移植腫瘤的各各階段中卻不是這樣。尤其在用5-氮雜-2'脫氧胞苷和雄激素聯(lián)合處理的各各階段中，MiR-146a的表達(dá)顯著擴(kuò)增。此外，在miR-146a啟動(dòng)子結(jié)合部位的兩個(gè)CpG位點(diǎn)（-444bp和-433bp）的去甲基化百分比顯示在聯(lián)合處理腫瘤的各各階段CpG位點(diǎn)去甲基化水平最低。通過(guò)5-氮雜-2'脫氧胞苷處理低甲基化的miR-146a啟動(dòng)子上調(diào)miR-146a的表達(dá)，與延緩雄激素抵抗的前列腺癌有關(guān)。此外，在雄激素依賴(lài)的前列腺癌進(jìn)展成非雄激素依賴(lài)的前列腺癌中，位點(diǎn)專(zhuān)一的DNA甲基化對(duì)miR-146a的表達(dá)有重要作用。因此為評(píng)價(jià)前列腺癌的藥效提供了潛在的有用的生物學(xué)標(biāo)記物[21]。

2.5膀胱癌是高復(fù)發(fā)的腫瘤，需要行特殊的經(jīng)尿道切除術(shù)和膀胱內(nèi)灌注化療[22]。目前臨床上發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤對(duì)傳統(tǒng)化療藥物存在多藥耐藥性，這也就促使我們更加努力地尋找新的治療藥物和早期診斷工具[23]。蛋白表達(dá)的特殊改變可以提供診斷膀胱腫瘤標(biāo)志物。在人膀胱癌細(xì)胞，5-氮雜-2'脫氧胞苷增加了GSTM1 mRNA和蛋白的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明在泌尿上皮腫瘤中GSTM1的下調(diào)是膀胱腫瘤發(fā)生的標(biāo)志物，并且這可以被基因的去甲基化所調(diào) 節(jié)[24]。目前也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，5-氮雜-2'脫氧胞苷對(duì)膀胱腫瘤T24細(xì)胞生物學(xué)行為有影響，腫瘤細(xì)胞凋亡增加。膀胱腫瘤中XIFI基因表達(dá)水平上調(diào)，XIAP基因無(wú)明顯改變，XAF-1蛋白表達(dá)上調(diào)、NF-KBP65蛋白上調(diào)，并且與5-氮雜-2'脫氧胞苷有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系[25]。

3結(jié)論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多基因作用的結(jié)果，當(dāng)然這些作用機(jī)制在各個(gè)腫瘤中不是唯一的，其他指標(biāo)也有改變，有待我們進(jìn)一步研究。同時(shí)為我們?cè)谂R床上遇到腫瘤耐藥情況提供了新的聯(lián)合用藥思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]方寧，農(nóng)曉琳.腫瘤多藥耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2008（06）：553-556.

[2]張暉輝.沉默VEGF-C基因后膀胱癌T24細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)及maspin蛋白的表達(dá)和功能研究[J].中南大學(xué)，2012：116.

[3]Hackanson， B. and M. Daskalakis， Decitabine[J].Recent Results Cancer Res，2014，201：269-297.

[4]Oki， Y.， E. Aoki and J.P. Issa， Decitabine-bedside to bench[J].Crit Rev Oncol Hematol， 2007，61（2）： 140-152.

[5]Zhang， C.， D.M. Wan and W.J. Cao， [Reversal Effect of Cinobufacini on Multidrug Resistance of Raji/ADR Cells and Its Mechanisms][J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi， 2014，22（5）： 1306-1310.

[6]Momparler， R.L.， Cancer epigenetics[J].Oncogene， 2003，22（42）： 6479-6483.

[7]Bender， C.M.， M.M. Pao and P.A. Jones， Inhibition of DNA methylation by 5-aza-2'-deoxycytidine suppresses the growth of human tumor cell lines[J].Cancer Res，1998，58（1）： 95-101.

[8]韓雨生，梁力建，黃潔夫.消化道腫瘤多藥耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2000，（05）： 426-427.

[9]Kanda， T.， et al.， 5-aza-2'-deoxycytidine sensitizes hepatoma and pancreatic cancer cell lines[J].Oncol Rep， 2005，14（4）： 975-979.

[10]丁大朋.肝腫瘤細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)，2008：41.

[11]Liu， W.J.， et al.5-Aza-2<-deoxycytidine induces hepatoma cell apoptosis via enhancing methionine adenosyltransferase 1A expression and inducing S-adenosylmethionine production[J]. Asian Pac J Cancer Prev， 2013，14（11）： 6433-6438.

[12]Liu， W.J.， et al.5-Aza-2<-deoxycytidine induces hepatoma cell apoptosis via enhancing methionine adenosyltransferase 1A expression and inducing S-adenosylmethionine production[J]. Asian Pac J Cancer Prev， 2013，14（11）：6433-6438.

[13]Wang， H.， et al.Promotive role of recombinant HE4 protein in proliferation and carboplatin resistance in ovarian cancer cells[J].Oncol Rep， 2014.

[14]Glasspool， R.M.， et al.A randomised， phase II trial of the DNA-hypomethylating agent 5-aza-2'-deoxycytidine （decitabine） in combination with carboplatin vs carboplatin alone in patients with recurrent， partially platinum-sensitive ovarian cancer[J].Br J Cancer， 2014，110（8）：1923-1929.

[15]Li， B.， et al.Clinical literature based statistical analysis of common Chinese medical syndrome types[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi， 2014，34（8）： 1013-1016.

[16]Finkelstein， S.E.， et al.Cellular immunotherapy for soft tissue sarcomas[J].Immunotherapy， 2012，4（3）： 283-290.

[17]Krishnadas， D.K.， T. Shapiro and K. Lucas， Complete remission following decitabine/dendritic cell vaccine for relapsed neuroblastoma[J].Pediatrics， 2013，131（1）： e336-41.

[18]Krishnadas， D.K.， et al.Decitabine facilitates immune recognition of sarcoma cells by upregulating CT antigens， MHC molecules， and ICAM-1[J].Tumour Biol， 2014. 35（6）：5753-5762.

[19]Shen， F.R.， et al.， Relationship between multidrug resistance 1 polymorphisms and the risk of prostate cancer in Chinese populations[J].Genet Mol Res，2013，12（3）：3806-3812.

[20]李俊楓，等.5-雜氮-2'-脫氧胞苷調(diào)控UCHL1基因表達(dá)對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J].激光雜志，2013，（06）：107-109.

[21]Wang， X.，et al.Demethylation of the miR-146a promoter by 5-Aza-2'-deoxycytidine correlates with delayed progression of castration-resistant prostate cancer[J].BMC Cancer， 2014，14：308.

[22]Medani， S.， et al.Bladder cancer in renal allograft recipients： risk factors and outcomes[J]. Transplant Proc， 2014，46（10）：3466-3473.

[23]李永生.膀胱腫瘤多藥耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué).泌尿系統(tǒng)分冊(cè)，2003，（02）：143-147.

[24]Chuang， J.J.， et al.， Downregulation of glutathione S-transferase M1 protein in N-butyl-N-（4-hydroxybutyl）nitrosamine-induced mouse bladder carcinogenesis[J].Toxicol Appl Pharmacol， 2014，279（3）： 322-330.

[25]胡勝，5-Aza-CdR對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制的研究[J].中南大學(xué)，2010：107. 編輯/肖慧