腸道病毒71型（EV71）的檢測

[摘要] 目的 探討腸道病毒71型（EV71）的檢測方法。 方法 采用酶聯(lián)免疫法（ELISA法）、 免疫膠體金法（膠體金法）、 熒光定量PCR法（PCR法）對1399例手足口病患兒的樣本進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。 結(jié)果 1399例手足口病患兒樣本ELISA法、金標(biāo)法、PCR法結(jié)果的陽性率分別為37.8%、36.0%、39.8%，三種方法檢驗(yàn)結(jié)果無顯著性差異（χ2=4.197，P>0.05）。ELISA法與膠體金法及PCR法結(jié)果比較均無顯著性差異（χ2=0.959，P>0.05；χ2=1.180，P>0.05）；膠體金法與PCR法兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.26，P<0.05）。 結(jié)論 這三種腸道病毒71型（EV71）檢測方法無顯著差異，但膠體金法方便快捷，PCR法精準(zhǔn)，ELISA法可作為常規(guī)使用。

[關(guān)鍵詞] 腸道病毒；EV71；膠體金法； ELISA；PCR

[中圖分類號] R446.6；R450 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2015）20-0093-03

Detection of enterovirus 71 （EV71）

ZHANG Xianhua

Laboratory Department， the Fifth People's Hospital of Anyang City in He'nan Province， Anyang 455000， China

[Abstract] Objective To investigate the enterovirus 71 （EV71） detection methods. Methods Samples from 1399 children with hand， foot and mouth disease were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， immune colloidal gold method （colloidal gold method） and fluorescence quantitative PCR method （PCR method）， and the chi-square test was conducted on these detention results. Results The positive rates of samples from 1399 children with hand， foot and mouth disease by the ELISA method， the gold standard method and the PCR method were 37.8%， 36.0% and 39.8%， respectively， without significant difference（χ2=4.197， P>0.05）. The colloidal gold method and the PCR method had no significant differences （χ2=0.959， P>0.05； χ2=1.180， P> 0.05）. The colloidal gold method and the PCR method， had significant difference between the two methods （χ2=4.26， P<0.05）. Conclusion There is no significant difference among the three enterovirus 71 （EV71） detection methods. But the colloidal gold method is more convenient， and the PCR method is more precise. ELISA method can be used for routine detection.

[Key words] Enterovirus； EV71； Colloidal gold method； ELISA； PCR

腸道病毒71型（EV71）是一類常見的經(jīng)呼吸道和消化道感染人體的病毒。可經(jīng)腸道（糞-口途徑）傳播，也可經(jīng)呼吸（飛沫、咳嗽、打噴嚏等）傳播，亦可因接觸患者口鼻分泌物、皮膚或黏膜皰疹液及被污染的手及物品等造成傳播。以5歲及以下兒童為主，尤以3歲以下的兒童發(fā)病率最高。EV71感染可導(dǎo)致手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、腦炎、肺炎、心肌炎等癥狀或并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[1-3]。所以探尋一個快速、準(zhǔn)確的檢測方法十分必要。我科為此對1399例手足口病患者的樣本分別采用ELISA法、膠體金法、PCR法進(jìn)行檢測，并將檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1399例手足口患兒均來自我院2014年4月1日～9月30日住院患者，診斷符合2012年國際手足口病會議關(guān)于手足口病診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，其中男887例，女512例；平均年齡2.8歲。標(biāo)本ELISA法、膠體金法用普通真空負(fù)壓管采集靜脈血后，分離血清；PCR法用無菌咽拭子采集患兒咽峽部黏膜皰疹液。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器 SLAN-96P全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)，上海宏石醫(yī)療科技有限公司；RT-2100C酶標(biāo)分析儀、RT-2600C全自動洗板機(jī)，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。操作由專業(yè)技術(shù)人員嚴(yán)格按操作規(guī)程操作。

1.2.2 試劑 膠體金法 腸道病毒71型IGM抗體檢測試劑盒，北京新興四環(huán)生物技術(shù)有限公司；ELISA法 腸道病毒71型抗體（IGM）檢測試劑盒，北京貝爾生物工程有限公司；PCR法 腸道病毒71型核酸檢測試劑盒，湖南圣湘生物科技有限公司。

1.3方法

①膠體金法：采用膠體金免疫層析技術(shù)原理[5]，在金標(biāo)墊上包被膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgM。用于定性檢測全血、血清或血漿樣品中的腸道病毒71型IgM抗體（EV71-IgM）。檢測陽性樣品時，樣品中的腸道病毒71型IgM抗體可與膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgM結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，由于層析作用復(fù)合物及樣品在硝酸纖維素膜內(nèi)部向前流動，當(dāng)復(fù)合物經(jīng)過T線時與包被的重組EV71-Ag結(jié)合，形成“Au-鼠抗人IgM- EV71-IgM-EV71-Ag”而凝集顯色、剩余的膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgM與C線處包被的羊抗鼠IgG抗體結(jié)合而凝集顯色，檢測陰性樣品時，樣品中不含腸道病毒71型IgM抗體，致使不能形成免疫復(fù)合物，則只能在C線處顯色。②ELISA法：采用捕獲法原理檢測人血清或血漿樣品中腸道病毒71型IgM抗體（EV71-IgM），微孔中預(yù)包被鼠抗人IgM（μ鏈）。首先加入待檢標(biāo)本的血清或血漿樣品后，樣品中的IgM抗體都可被捕獲，未結(jié)合的其他成份（包括特異性的IgG抗體）將被洗滌除去；第二步：加入腸道病毒71型抗原標(biāo)記酶，被捕獲的IgM中的EV71-IgM會與辣根過氧化物酶標(biāo)記的EV71重組抗原特異性結(jié)合，洗去其他未結(jié)合物，最后加底物TMB顯色，通過酶標(biāo)儀檢測吸光度（A值）從而判定樣品中的EV71-IgM抗體的存在與否；③PCR法：在體外模擬病毒核酸的復(fù)制過程，針對EV71核酸保守區(qū)設(shè)計特異性引物和特異性熒光探針，配以RT-PCR反應(yīng)液，在熒光定量PCR儀上，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)，通過熒光信號的變化實(shí)現(xiàn)EV71-RNA的快速檢測；其檢測體系中含有陽性內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)），通過檢測內(nèi)標(biāo)是否正常來監(jiān)測待測樣本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假陰性；通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對得出定量結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

1399例手足口病患兒的樣本分別采用ELISA法、膠體金法、PCR法進(jìn)行檢測，其腸道病毒71型檢測結(jié)果見表1。ELISA法與膠體金法、PCR法比較均無顯著性差異（χ2=0.959，P>0.05；χ2=1.180，P>0.05）；膠體金法與PCR法比較，兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.26，P<0.05）。

3討論

目前隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，相關(guān)的檢驗(yàn)技術(shù)也得到了不斷提高，檢驗(yàn)方法也層出不窮，檢測的準(zhǔn)確性、靈敏度也大大增加；病毒的檢測方法也從血清學(xué)發(fā)展到分子生物學(xué)檢測。腸道病毒71型（enterovirus71，EV 71）作為引起手足口?。╤and foot mouth disease， HFMD）的最常見病毒，不僅可引起患兒發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，還可引起個別患者心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥；更是重癥患兒的原兇[4，6-10]。近年手足口病流行，國家疾控部門非常重視，其檢測技術(shù)也更加完善齊全。

膠體金免疫技術(shù)（colloial gold immunoassay）是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種標(biāo)記免疫測定技術(shù)[11]。金標(biāo)法是國際上較為先進(jìn)的、靈敏、特異、快速、簡便、準(zhǔn)確率高的體外診斷方法。測定結(jié)果僅憑特制的檢驗(yàn)盒在短時間內(nèi)即可獲得。

ELISA技術(shù)將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶高效催化底物的敏感性結(jié)合，反應(yīng)在固相上進(jìn)行，便于洗凈對試驗(yàn)有干擾的非特異無關(guān)物質(zhì)，操作快速簡便，可定性也可定量報告結(jié)果，適于大批量標(biāo)本檢測；其憑借高度的敏感性和特異性、操作簡便以及試劑穩(wěn)定、對環(huán)境沒有污染等特點(diǎn)，目前仍是臨床常規(guī)、科研工作的重要技術(shù)手段之一[11-12]。手足口病抗體檢測的最常用方法仍是血清學(xué)試驗(yàn)、血清中和實(shí)驗(yàn)及酶聯(lián)免疫法；該方法精確且具有型特異性。LMB組合血清可大大簡化鑒定過程，但是有些毒株的中和作用不穩(wěn)定，仍需由單價血清來鑒定，另一要注意的是病毒顆粒的集聚會影響中和效果，如EV71的中和實(shí)驗(yàn)就需要使用單個分散的病毒。而ELISA法相比而言操作簡便，可大批量自動化進(jìn)行，成本低廉，患者易于接受。

PCR技術(shù)是從分子生物學(xué)水平直接檢測被檢病毒自身的遺傳物質(zhì)，是病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的標(biāo)準(zhǔn)[11]。已成為診斷病毒感染常用的一種方法，是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作專業(yè)性強(qiáng)，成本貴，檢測費(fèi)用高，患者難以承受。

由于方法學(xué)的局限性，膠體金法的檢測結(jié)果由人肉眼觀察判讀，易受目測誤差或主觀判讀等因素影響，因此，當(dāng)條帶顏色不易明確判斷時，建議重復(fù)檢測；膠體金法的檢測結(jié)果作為診斷的輔助手段之一，檢測結(jié)果僅供參考，不作為臨床診治的唯一依據(jù)，陽性結(jié)果需采用其他方法進(jìn)一步確認(rèn)。感染初期，IgM未產(chǎn)生或滴度很低會導(dǎo)致金標(biāo)法和ELISA法結(jié)果陰性，應(yīng)提示患者1～2周內(nèi)復(fù)查，復(fù)查時同時平行檢測上次采集的標(biāo)本以確認(rèn)是否出現(xiàn)血清學(xué)陽轉(zhuǎn)或滴度明顯升高。對于免疫功能受損或接受免疫抑制治療的患者，其血清學(xué)抗體檢測的參考價值有限。應(yīng)采用單克隆抗體間接免疫熒光法檢測病毒抗原、RT-PCR技術(shù)檢測病毒核酸進(jìn)行快速診斷[13-14]。

對于金標(biāo)法和ELISA法其檢測樣本有一定要求：①靜脈采集的樣本，無論抗凝或非抗凝標(biāo)本首先要及時充分離心分離血清或血漿，然后取澄清的液體進(jìn)行檢測，如果末充分沉淀，懸浮的纖維蛋白可引起ELISA法假陽性和影響金標(biāo)法的檢測。②標(biāo)本中含有EDTA、枸櫞酸鈉、肝素鈉等抗凝劑時，通常不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；輕度膽紅素、血紅蛋白、血脂樣本通常不會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但含量過高時則影響檢驗(yàn)結(jié)果。③乙肝、丙肝、類風(fēng)濕因子、EB病毒、CMV病毒、風(fēng)疹病毒等相關(guān)疾病通常不會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。④血清或血漿樣本收集后5 d內(nèi)檢測可4℃冷藏保存，大于5 d檢測樣本應(yīng)放置-20℃冷凍保存，且避免反復(fù)凍融，最多不超過3次。金標(biāo)法和ELISA法試劑要根據(jù)用量，用多少取多少，用前先讓試劑恢復(fù)室溫；用后及時收起，放置冰箱冷藏。PCR法則要求專業(yè)技術(shù)人員實(shí)驗(yàn)前熟悉和掌握所需試劑和儀器的操作方法和注意事項(xiàng)，對每次試驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制；嚴(yán)格按照PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范和操作規(guī)程進(jìn)行操作，避免交叉污染，確保結(jié)果準(zhǔn)確無誤。

由上述結(jié)果可以看出，采用ELISA法、膠體金法、PCR法進(jìn)行腸道病毒71型檢測，其結(jié)果差異性不大；各醫(yī)療機(jī)構(gòu)可根據(jù)不同診療目的和人群進(jìn)行適當(dāng)選擇，檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床檢查、病史及其他檢測綜合分析診斷。

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（收稿日期：2015-04-23）