Snail+Slug在宮頸癌組織中的表達及其臨床意義

[摘要] 目的 探討Snail+Slug在宮頸癌組織中的表達及其臨床意義。 方法 利用免疫組化檢測Snail+Slug在60例宮頸癌組織和40例正常宮頸組織中的表達，分析Snail+Slug在宮頸癌組織中的表達狀況以及與宮頸癌臨床參數(shù)的關(guān)系。 結(jié)果 Snail+Slug在宮頸癌組織和正常宮頸組織中陽性表達率分別為71.7%（43/60）、17.5%（7/40），兩組間有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=29.917，P<0.05）；Snail+Slug在宮頸癌組織中的表達明顯高于正常宮頸組織，在正常組織中偶見核表達。Snail+Slug的過表達與患者年齡無關(guān)（χ2=0.002，P>0.05），與宮頸癌的組織學(xué)分化程度、臨床分期、有無淋巴轉(zhuǎn)移等有明顯相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 Snail+Slug在宮頸癌中高表達，提示其可能參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并有望成為臨床診斷及評價患者預(yù)后的新型標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] Snail+Slug；宮頸癌；免疫組化

[中圖分類號] R737.33 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）20-0004-04

Expression and its clinical significance of Snail+Slug in the tissues of cervical cancer

LIU Minjie1 FANG Laifu2 HU Pingping1 WENG Ke'na2 WANG Ke'na1 YAN Chunhong1

1.Department of Gynecology， Yinzhou Hospital Affiliated to Medical School of Ningbo University， Ningbo 315040， China； 2.Department of Pathology， Yinzhou Hospital Affiliated to Medical School of Ningbo University， Ningbo 315040， China

[Abstract] Objective To explore the expression of Snail+Slug in the tissues of cervical cancer and its clinical significance. Methods The expression of Snail+Slug in 60 cases of cervical cancer tissues and 40 healthy cervical tissues were tested by immunohistochemistry， and the expression of Snail+Slug in the tissues of cervical cancer as well as its correlations with the clinical parameters of cervical cancer were analyzed. Results The positive expression rates of Snail+Slug in tissues of cervical cancer and healthy cervical tissues were 71.7% （43/60） and 17.5% （7/40） respectively， and there was statistical significance between the two groups （χ2=29.917， P<0.05）； the expression of Snail+Slug in the tissues of cervical cancer was significantly higher than that in the healthy cervical tissues， and its expression was rarely seen in healthy tissues. The overexpression of Snail+Slug was not correlated with patients’ age （χ2=0.002， P>0.05）， and was significantly correlated with histological differentiation degree， clinical staging and lymphatic metastasis of the cervical cancer. The differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion The overexpression of Snail+Slug in cervical cancers indicates that it may be involved in the genesis and development of tumor， which is expected to become a new marker for clinical diagnosis and assessment of patients’ prognosis.

[Key words] Snail+Slug； Cervical cancer； Immunohistochemistry

Snail和Slug都是Snail鋅指轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，Snail超家族成員有Snail、E12/E47、ZEB1、SIP1、Slug。在結(jié)構(gòu)特征上，Snail超家族大多具有類似的結(jié)構(gòu)，都由一個高度可變的氨基末端和一個非常保守的羧基末端構(gòu)成，相互之間結(jié)構(gòu)上的不同大多表現(xiàn)在中間富集P-S的區(qū)域。Snail和Slug是在上皮和間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）過程中發(fā)揮重要作用的的調(diào)節(jié)因子[1]。很多研究表明，肺癌[2]、胃癌[3]、乳腺癌[4，5]、結(jié)直腸癌[6]、胰腺癌[7]和肝癌[8]等上皮來源的惡性腫瘤中一般都可發(fā)生EMT現(xiàn)象，腫瘤細胞發(fā)生EMT后獲得了更強的轉(zhuǎn)移能力和侵襲力。作為轉(zhuǎn)錄抑制因子的Snail+Slug基因，可以通過抑制E-鈣黏附蛋白的表達及活性來參與腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，促進這些上皮性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。Snail+Slug抗體對人Snail全長的重組蛋白進行了標(biāo)記。本文擬通過檢測正常宮頸組織和宮頸癌組織中Snail+Slug的過表達量，觀察Snail+Slug在宮頸癌組織中的表達情況，探討在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中Snail+Slug的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及分組

收集本院2013年1月～2014年8月手術(shù)切除及活檢標(biāo)本100例，其中正常宮頸組織40例；宮頸浸潤癌60例。宮頸癌按組織學(xué)分級分為：高分化24例，中分化20例，低分化16 例；按2000年FIGO臨床分期分為Ⅰ期31例，Ⅱ期25例，Ⅲ期4例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。所有患者術(shù)前及活檢前均未接受化療或放療。年齡25～67歲，平均（51.0±9.2）歲，中位年齡50歲。所有標(biāo)本的診斷數(shù)據(jù)均經(jīng)病理證實， 并附有完整的臨床病理資料?；颊咝g(shù)前均未接受化療或放療。研究所用病理標(biāo)本均有完整的病理診斷數(shù)據(jù)和臨床資料?；颊呤中g(shù)前均未接受過化療或放療。

1.2 試劑與方法

應(yīng)用免疫組化SP方法檢測Snail+Slug。Snail+Slug抗體購自美國Santa Cruz公司，SP試劑盒夠自北京中杉生物技術(shù)有限公司，并提供試劑盒和基本操作方法。Snail+Slug實驗步驟：①石蠟切片3～4 μm，65℃烤片過夜；②組織切片脫蠟、水化；③滅活內(nèi)源性過氧化物酶（3%H2O2，10 min）；④用PBS沖洗3次，每次2 min；⑤抗原熱修復(fù)（EDTA pH=9.0，20 min）；⑥蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次，每次2 min；⑦正常封閉血清（羊血清工作液，室溫下10 min）；⑧傾去血清加一抗室溫1 h；⑨蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次，每次2 min；⑩二抗，即用型廣譜試劑盒，室溫 25 min；{11}蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次，每次2 min；{12}DAB顯色3～10 min（即用型DAB顯色液，鏡下控制）；{13}蘇木素復(fù)染、藍化；{14}切片經(jīng)過脫水，透明，封片具體操作步驟嚴格按照說明進行。用預(yù)實驗陽性片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照，用一張組織蠟塊連續(xù)切片做常規(guī)HE染色，用于腫瘤組織免疫組化陽性部位的對照判定和分析。

1.3 結(jié)果判斷

隨機選擇10個高倍（×400）視野，采用雙盲法綜合考慮切片中陽性細胞著色強度和陽性細胞所占比例兩項指標(biāo)，顯微鏡下半定量判斷結(jié)果。全部切片均由兩位病理醫(yī)生仔細閱片兩次，確保結(jié)果的可重復(fù)性。Snail+Slug主要定位于細胞質(zhì)和細胞核。評分標(biāo)準如下：（1）陽性細胞百分率：（a）無著色，0分；（b）<10%，1分；（c）10%～50%，2分；（d） >50%，3分。（2）腫瘤顯色深淺：（a）基本不著色，0分；（b）淺黃色，1分；（c）黃棕色，2分；（d）棕褐色，3分。最終評定結(jié)果為以上兩項相加：（1）0～2分為陰性（-）；（2）3～4分為弱陽性（+）；（3）5～6分為強陽性（++）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用校正卡方檢驗組間差異的顯著性，采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Snail+Slug表達情況

Snail+Slug在正常組織中表達較低，陽性率為17.5%（7/40），在宮頸癌組織中的表達明顯增高，陽性率為71.7%（43/60），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=29.917，P<0.01），見表1。

表1 Snail+Slug在正常宮頸組織和宮頸癌組織中表達情況分析

[n（%）]

2.2 Snail+Slug表達與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

在表1中，Snail+Slug在宮頸癌組織中的陽性表達率71.7%（43/60）。但是宮頸癌的陽性表達隨宮頸癌組織的病理分化程度的降低而升高，Snail+Slug在低分化宮頸癌組織的陽性表達（16/16，100.0%）明顯高于中分化癌17/20，85.0%）和高分化癌（10/24，41.7%），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.423，P<0.01）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌的陽性強度（20/22，90.9%）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（23/38，60.5%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.364，P<0.01）；在宮頸癌中臨床分期高度低（16/31， 51.6%）比臨床分期高（27/29，93.1%）的患者陽性率低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.435，P<0.01）；Snail+Slug陽性表達率與宮頸癌患者年齡無關(guān)（P>0.05）。見表2。

表2 Snail+Slug表達與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系（n）

2.3 Snail+Slug在正常宮頸組織和宮頸癌組織中的表達情況

見封三圖1～4。

3 討論

宮頸癌在全球女性腫瘤中的發(fā)病率占第3位，死亡率占第4位[9]，我國是宮頸癌的高發(fā)地區(qū)， 研究認為宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展與多種癌基因和抑癌基因的表達、調(diào)控及細胞凋亡及一些侵襲和轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)，其機制目前仍不明確。目前研究認為宮頸癌是可以預(yù)防和治愈的，因此尋找并發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過程中的敏感指標(biāo)，阻斷其發(fā)病，遏制其侵襲和轉(zhuǎn)移，最終減少宮頸癌的發(fā)生，幫助臨床早期診斷、早期治療和判斷轉(zhuǎn)歸，都具有非常重要的意義。

Slug和Snail基因分別是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄抑制因子——Snail基因超家族其中的成員之一，Snail家族基因在脊椎動物中胚葉組織和神經(jīng)脊的形成中具有重要的作用[10，11]，同時它們介入到中胚層細胞上皮一間葉變EMT的過程中，導(dǎo)致上皮細胞從上皮中解離出來并遷移到不同的間葉細胞區(qū)域，所以在很多發(fā)生EMT現(xiàn)象的間葉細胞，如牙齒、肺、腎、心內(nèi)膜細胞等組織中高表達[12，13]，所以也被認為是一種間葉源性標(biāo)志物。除此之外，Slug和Snail基因與細胞周期調(diào)節(jié)、細胞動力學(xué)、細胞增殖及細胞凋亡等都有著密切的關(guān)系[14]，其過表達會使細胞間連接缺失，細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞獲得侵襲潛能，也可以增強細胞對因DNA損傷所發(fā)生的程序性死亡的耐受性，促進了腫瘤的發(fā)生[15]。

本文發(fā)現(xiàn)Snail+Slug在宮頸癌組織中的高表達71.7%（43/60），而且宮頸癌的陽性表達隨宮頸癌組織的病理分化程度的降低而升高，Snail+Slug在低分化宮頸癌組織的陽性表（16/16，100.0%）明顯高于中分化癌17/20，85.0%）和高分化癌（10/24，41.7%），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.423，P<0.01）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌的陽性強度（20/22，90.9%）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（23/38，60.5%），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.364，P<0.01）；在宮頸癌中臨床分期低（16/31，51.6%）比臨床分期高（27/29，93.1%）的患者陽性率低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.435，P<0.01）；但Snail+Slug陽性表達率與宮頸癌患者年齡無關(guān)（χ2=0.002，P>0.05）。Snail+Slug在宮頸癌組織中高表達，在正常宮頸組織中低表達。同時Snai+Slug隨著腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、宮頸癌分化的進展、臨床分期的升高而顯著升高，與腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲的過程一致，說明了Snail+Slug可使宮頸癌細胞發(fā)生EMT現(xiàn)象，細胞間同質(zhì)黏附降低，細胞極性喪失，細胞器重新分配，細胞骨架重組，細胞最終獲得了侵襲轉(zhuǎn)移的惡性潛能，與宮頸癌的臨床進展及預(yù)后有關(guān)。但是針對Snail家族成員的研究目前還有很多的盲點，Snail家族成員在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的表達與腫瘤分化程度、類型、臨床分期和預(yù)后等方面的關(guān)系都有待于進一步的探索研究。針對Snail+Slug轉(zhuǎn)錄因子——“惡性腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲潛能可能的標(biāo)志物”的進一步深入的研究，我們相信不僅為研究腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程提供一個新的視角和開發(fā)腫瘤治療的新天地，并且也會進一步推動外科治療惡性腫瘤的生物學(xué)反應(yīng)調(diào)控研究。

通過實驗結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)Snail+Slug促進了宮頸正常上皮細胞發(fā)生間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，提高了宮頸癌組織的侵襲和轉(zhuǎn)移的惡性潛能，進一步為宮頸癌轉(zhuǎn)移的分子機制提出了有力的理論證據(jù)，也為宮頸癌的靶向逆轉(zhuǎn)治療提供了新的參考靶點。目前已經(jīng)有研究者將Snail家族作為抗腫瘤治療靶點的研究對象，通過Snail基因的siRNA轉(zhuǎn)染入SGC7901細胞，Snail siRNA可通過抑制Snail mRNA的表達水平進而抑制SGC7901細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。通過siRNA沉默Snail基因的表達也可體外降低SGC7901細胞的侵襲、增殖和轉(zhuǎn)移能力[16]，通過amiRNA-Snail沉默Snail基因表達可下調(diào)ERCC1的表達和上調(diào)E-cadherin的表達，從而可以逆轉(zhuǎn)人的胃癌細胞株SGC7901/DDP對DDP的耐藥性[17]，這提示Snail+Slug在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，未來有可能作為腫瘤基因治療的一個有效的靶點。由于Snail+Slug與宮頸癌的診斷和預(yù)后都存在一定的關(guān)系，未來很可能是一個潛在的宮頸癌的腫瘤標(biāo)志物和新的化療藥物靶點基因，為宮頸癌的診斷和治療提供新的思路。

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（收稿日期：2015-03-19）