血管平滑肌細(xì)胞外泌體在血管鈣化中的作用

侯淑潔 張 勉 王賀林

血管鈣化在糖尿病、慢性腎臟疾病和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中常見[1]。研究表明，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)來源的外泌體在血管鈣化的過程中發(fā)揮了重要作用，研究外泌體在血管鈣化中的作用機(jī)制對(duì)于心血管疾病的防治有重要意義。

一、外泌體

外泌體首次由Johnsone在體外培養(yǎng)網(wǎng)織紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，與網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟為紅細(xì)胞的過程相關(guān)。外泌體在核內(nèi)體網(wǎng)絡(luò)中形成，部分晚期核內(nèi)體靶向與質(zhì)膜融合后將包含的30～100nm囊泡至細(xì)胞外腔，成為外泌體。外泌體是細(xì)胞外的生物信息載體之一，可以向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)多種類型的功能性轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起受體細(xì)胞表型改變[2]。不同類型的細(xì)胞通過旁分泌等方式將外泌體分泌到體液或各種微環(huán)境中，并在鄰近區(qū)域或遠(yuǎn)處細(xì)胞中發(fā)揮作用[3]。外泌體在臨床中的應(yīng)用價(jià)值很大，研究表明，循環(huán)系統(tǒng)中外泌體內(nèi)長鏈非編碼RNA可以作為早期檢測和監(jiān)測胃癌進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物[4]?？筛鶕?jù)外泌體中蛋白表達(dá)的差異篩選潛在的藥物靶標(biāo)蛋白[5]。起源于血管內(nèi)皮細(xì)胞的病理性外泌體、基質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在血管鈣化中發(fā)揮重要作用。因此外泌體不僅參與炎癥、增生、血栓形成、血管活性反應(yīng)等生理病理過程，還能促進(jìn)血管鈣化。

二、血管鈣化

血管鈣化是礦物質(zhì)在血管系統(tǒng)中的病理沉積，導(dǎo)致血管壁彈性降低和血管結(jié)構(gòu)完整性受損。血管鈣化影響廣泛，它不僅是正常衰老的一部分，也與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、某些遺傳疾病和腎臟疾病有關(guān)，目前臨床上仍無有效的血管鈣化治療方法[6]。通常根據(jù)鈣化物在血管中沉積部位不同將其分為內(nèi)膜鈣化和中膜鈣化(也稱monckeberg內(nèi)側(cè)鈣化)。內(nèi)膜鈣化與脂質(zhì)沉積和炎性細(xì)胞浸潤密切相關(guān)，在粥樣硬化病變中常見。而內(nèi)側(cè)鈣化顯著表現(xiàn)為VSMCs轉(zhuǎn)化為成骨樣細(xì)胞。內(nèi)側(cè)鈣化是一個(gè)主動(dòng)的生物調(diào)節(jié)過程，類似于骨形成，可導(dǎo)致血管硬度增加和血管順應(yīng)性降低。血管鈣化原因復(fù)雜，包括VSMCs的不穩(wěn)定性增加、鈣/磷酸鹽調(diào)控失常、彈性蛋白的降解、破骨細(xì)胞的分化和凋亡等[7]。來自VSMCs、基質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的外泌體是心臟瓣膜和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊鈣化的重要介質(zhì)。

三、血管平滑肌細(xì)胞及其外泌體可參與血管鈣化

1.血管平滑肌與鈣化：VSMCs為血管提供結(jié)構(gòu)支持并使其具有收縮功能，在健康成人血管中，它們以極低的速率增殖，并表達(dá)獨(dú)特的收縮蛋白。在血管損傷的修復(fù)、應(yīng)答血流動(dòng)力學(xué)改變時(shí)的血管重塑，或在各種疾病狀態(tài)時(shí)，它們會(huì)去分化為一種合成表型，從而分泌外泌體、增殖、并遷移到損傷處進(jìn)行修復(fù)。這個(gè)過程被稱為表型轉(zhuǎn)換，通常為血管病變的第一步。血管系統(tǒng)的一些病變與VSMCs的表型轉(zhuǎn)化有關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄和鈣化等[8]。

VSMCs是血管鈣化的關(guān)鍵因素。收縮型VSMCs向骨/軟骨形成型VSMCs的表型轉(zhuǎn)換過程伴隨著調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)礦化的骨特異性蛋白的表達(dá)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是成骨的主要調(diào)節(jié)因子，結(jié)合BMP受體并激活SMAD信號(hào)，從而導(dǎo)致骨/軟骨生成轉(zhuǎn)錄因子如RUNX2、Osterix的表達(dá)和活性增加，這些轉(zhuǎn)錄因子控制礦化調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，如組織非特異性堿性磷酸酶(tissue non-specific alkaline phosphatase，TNAP)、骨鈣素、骨橋蛋白、骨保護(hù)素和骨涎蛋白[9]。應(yīng)激信號(hào)可以通過多種機(jī)制誘發(fā)VSMCs凋亡增加和外泌體釋放，進(jìn)而促進(jìn)鈣化，此時(shí)外泌體內(nèi)成分改變，基質(zhì)γ-羧基谷氨酸蛋白(matrix gla protein，MGP)等天然鈣化抑制劑明顯減少[10]。

2.血管平滑肌來源的外泌體與鈣化：Tanimura在1983年的研究表明，基質(zhì)小泡(matrix vesicles，MVs)樣結(jié)構(gòu)參與動(dòng)脈粥樣硬化病變的鈣化以及動(dòng)脈內(nèi)側(cè)鈣化。在解剖患有動(dòng)脈粥樣硬化的人、兔、雞的主動(dòng)脈中，發(fā)現(xiàn)MVs源自內(nèi)膜中的細(xì)胞成分，主要源自VSMCs。Kapustin等[11]利用alexa488標(biāo)記的胎球蛋白A研究了MVs的生物發(fā)生在VSMCs鈣化中的調(diào)控和作用，并將MVs明確識(shí)別為外泌體。在長期的應(yīng)激和礦物質(zhì)失衡狀態(tài)下，VSMCs可以轉(zhuǎn)化為合成表型，而外泌體的分泌是合成表型VSMCs的一個(gè)重要特征，而后將其轉(zhuǎn)化為鈣化狀態(tài)。該過程最可能的途徑是激活鞘磷脂磷酸二酯酶3(sphingomyelin phosphodiesterase 3，SMPD3)和細(xì)胞骨架重構(gòu)。細(xì)胞外鈣水平升高引起VSMCs外泌體組成和磷脂酰絲氨酸、膜聯(lián)蛋白A6(annexin a6，AnxA6)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2的積累發(fā)生顯著變化，從而使外泌體變成一個(gè)鈣化的病灶。VSMCs釋放的鈣化外泌體是形成微鈣化的最小分子。材料成像技術(shù)顯示，VSMCs衍生的鈣化外泌體在向細(xì)胞外基質(zhì)釋放時(shí)，容易在膠原稀疏的區(qū)域聚集形成微鈣化，大的鈣化則是由微鈣化累積而成，并逐漸形成成熟的礦物質(zhì)。膠原蛋白作為支架來引導(dǎo)生長過程中鈣化的形狀和大小[12]。

四、血管平滑肌細(xì)胞來源外泌體的影響因素

1.鈣與磷酸鹽的影響：為了應(yīng)答礦物質(zhì)代謝失調(diào)，血管平滑肌會(huì)發(fā)生適應(yīng)性改變，包括外泌體的釋放。電子顯微鏡觀察在血管細(xì)胞外基質(zhì)中，不斷沉積的類似外泌體結(jié)構(gòu)的小囊泡內(nèi)含有鈣磷的結(jié)晶。這些適應(yīng)性改變最終造成了VSMCs的凋亡和異常鈣化。細(xì)胞外鈣水平升高可誘導(dǎo)VSMCs衍生的外泌體礦化。蛋白質(zhì)組學(xué)顯示，VSMCs來源的外泌體與軟骨細(xì)胞來源的MVs有相似之處，包括豐富的鈣結(jié)合蛋白，即膜聯(lián)蛋白A2、AnxA5和AnxA6，AnxA6在外泌體膜上的定位不同，其功能也有所差異[13]。帶有AnxA5和TNAP的外泌體與礦化血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的天然膠原蛋白基質(zhì)結(jié)合AnxA6可穿過質(zhì)膜，在體內(nèi)的血管鈣化部位也很豐富，而針對(duì)AnxA6的小干擾RNA則可以降低VSMCs礦化[14]。除了AnxA6之外，鈣誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸暴露于外泌體表面，從而提供了羥氧化鉀磷灰石的成核位點(diǎn)。與在軟骨細(xì)胞基質(zhì)囊泡中觀察到的協(xié)調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)相反，VSMCs外泌體的礦化是細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)紊亂的病理反應(yīng)，導(dǎo)致抑制劑消耗和AnxA6-磷脂酰絲氨酸成核復(fù)合物的形成。該研究表明維持正常血鈣水平、減少短暫性高鈣血癥的發(fā)作對(duì)心血管疾病患者，尤其是慢性腎病患者，具有很重要預(yù)防血管鈣化的意義。

VSMCs和成骨細(xì)胞具有相似的間充質(zhì)來源，在病理壓力下，VSMCs可以表現(xiàn)出成骨樣表型。在高磷酸鹽血液環(huán)境(如慢性腎臟疾病)或炎癥驅(qū)動(dòng)的動(dòng)脈粥樣硬化中，VSMCs上調(diào)成骨分化基因的表達(dá)，并釋放富含促鈣化生物學(xué)標(biāo)志物的外泌體[15]。高磷酸鹽血癥能夠降低循環(huán)系統(tǒng)中細(xì)胞外礦化抑制分子胎球蛋白-A和MGP蛋白的水平，但VSMCs外泌體中促進(jìn)細(xì)胞外礦化的TNAP和AnxA2、AnxA6的含量則升高，活性TNAP可導(dǎo)致磷酸增加，并減少焦磷酸等礦化抑制劑的含量。鈣化性外泌體的形成始于細(xì)胞內(nèi)一系列的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，分揀蛋白(sortilin)作為一種特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在VSMCs分泌的鈣化性外泌體形成中起關(guān)鍵作用。

sortilin將TNAP轉(zhuǎn)運(yùn)到VSMCs衍生的外泌體中，從而增加外泌體的鈣化潛能。研究表明鈣化外泌體的形成過程中，sortilin 通過反式高爾基體(trans-golgi network，TGN)來運(yùn)輸，經(jīng)過磷酸化，結(jié)合TNAP形成胞內(nèi)體，經(jīng)過了核內(nèi)的Rab11途徑到達(dá)細(xì)胞膜表面特定的小凹蛋白1。在此過程中，sortilin/TNAP復(fù)合物就會(huì)進(jìn)入外泌體，從而增強(qiáng)外泌體的促鈣化的作用。Nε-羧甲基賴氨不僅影響從VSMCs釋放外泌體，而且還影響sortilin進(jìn)入外泌體，從而促進(jìn)糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化[16]。這一發(fā)現(xiàn)可能為針對(duì)性預(yù)防糖尿病血管鈣化提供新的策略。此外，正常血管在對(duì)照和高P培養(yǎng)基中均未見囊泡標(biāo)志物AnxA6陽性，但在高Ca + P培養(yǎng)基中培養(yǎng)后在中膜中可見少量點(diǎn)狀陽性區(qū)域。而透析血管在對(duì)照中呈斑片狀彌散染色，在高P的培養(yǎng)基中陽性區(qū)域增加，在高Ca + P的培養(yǎng)基中陽性區(qū)域最大，這表明病變血管在高鈣高磷同時(shí)存在的條件下誘導(dǎo)沉積的外泌體最多，最易發(fā)生鈣化[17]。

此外，有研究還證實(shí)血管的鈣化擴(kuò)張是從鈣化的VSMCs延伸到鄰近的正常細(xì)胞，該過程通過外泌體誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)改變而實(shí)現(xiàn)。利用慢性腎臟病大鼠VSMCs中分離出的外泌體，與正常仔鼠的VSMCs共同培養(yǎng)，可見正常小鼠的VSMCs作為受體細(xì)胞對(duì)小泡的內(nèi)吞作用。外泌體還可通過誘導(dǎo)受體VSMCs的細(xì)胞信號(hào)改變和受體細(xì)胞的表型改變來加速受體VSMCs的鈣化。此外，只有VSMCs來源的外泌體可以誘導(dǎo)受體正常的VSMCs內(nèi)鈣離子濃度、NADPH氧化酶-1(nadph oxidase 1，NOX1)和抗氧化超氧化物歧化酶-2的含量升高。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加一方面是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的釋放，另一方面是部分歸因于NOX1和絲裂原激活蛋白激酶類(MEK1和Erk1/2)信號(hào)的激活，因?yàn)橐种七@兩種途徑都會(huì)阻止受體VSMCs細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加。相反，從培養(yǎng)基中分離的外泌體對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度或MEK1信號(hào)沒有影響，也沒有誘導(dǎo)鈣化。但這些外泌體確實(shí)增加了Erk1/2和NOX1的表達(dá)，阻斷NOX活性進(jìn)一步抑制了外泌體誘導(dǎo)的受體VSMCs鈣化加速，表明這種抑制具有潛在的治療作用[18]。

2.膠原纖維對(duì)外泌體釋放的調(diào)節(jié)作用：膠原纖維能夠結(jié)合和引導(dǎo)外泌體鈣化。VSMCs衍生的鈣化外泌體一旦釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，傾向于聚集在膠原稀疏的區(qū)域形成微鈣化，而大鈣化由微鈣化堆積而成，逐漸形成成熟礦物。將VSMCs在促鈣化條件下的膠原蛋白水凝膠體系內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，模擬動(dòng)脈粥樣硬化病變的各個(gè)時(shí)期，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白作為支架可以引導(dǎo)生長過程中產(chǎn)生的鈣化點(diǎn)的形狀和大小。動(dòng)脈中的I型和Ⅲ型膠原纖維，則能與外泌體膜結(jié)合并介導(dǎo)其在細(xì)胞外基質(zhì)中的鈣化傳播。膠原纖維也可能在VSMCs內(nèi)的表型改變和外泌體形成中發(fā)揮作用。盤狀結(jié)構(gòu)域受體-1(discoidin domain receptor，DDR-1)是一種膠原受體，它通過感受細(xì)胞外膠原成分變化調(diào)節(jié)VSMCs表型，缺乏DDR-1的VSMCs會(huì)增加膠原生成、外泌體釋放和礦物質(zhì)沉積[19]。研究證實(shí)，DDR-1通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)途徑調(diào)節(jié)VSMCs的膠原沉積和鈣化外泌體的釋放，而在動(dòng)脈粥樣硬化中，膠原積累和鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的主要決定因素[20]。因此，DDR-1與TGF-β通路相互作用對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成及其細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)機(jī)制具有重要意義[21]。Ⅰ型膠原蛋白序列中特定的六氨基酸重復(fù)序列(six-amino-acid repeat，GFOGER)參與了Ⅰ型膠原纖維與外泌體上表達(dá)的整合素的相互作用，可以降低VSMCs來源的外泌體中與鈣化有關(guān)蛋白的含量，從而抑制鈣化[22]。

3.其他影響因素：動(dòng)脈中層鈣化是由VSMCs異常釋放的外泌體介導(dǎo)，而細(xì)胞分泌的外泌體與溶酶體活性有關(guān)。黏質(zhì)蛋白1(mucolipin 1，Mcoln1)基因缺失的小鼠VSMCs內(nèi)溶酶體定位異常，外泌體分泌增多，這可能是導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)側(cè)鈣化的原因之一[23]。此外，動(dòng)脈內(nèi)側(cè)鈣化還與細(xì)胞外基質(zhì)、動(dòng)脈VSMCs中羥基鎂的結(jié)晶有關(guān)，從而導(dǎo)致動(dòng)脈順應(yīng)性降低。在溶酶氨基酸鞘磷脂酶(小鼠基因編碼:SMPD1)衍生的神經(jīng)酰胺是否促進(jìn)VSMCs分泌外泌體導(dǎo)致動(dòng)脈中層鈣化的研究中，發(fā)現(xiàn)SMPD1轉(zhuǎn)基因小鼠的溶酶體酸鞘磷脂酶(小鼠基因編碼：SMPD1)衍生的神經(jīng)酰胺在VSMCs的表型變化和外泌體的釋放中起著關(guān)鍵的作用，可能導(dǎo)致內(nèi)側(cè)鈣化的發(fā)展[24]。VSMCs中Asah1基因缺失也會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈中層鈣化[25]。在對(duì)外泌體釋放的調(diào)控途徑研究中發(fā)現(xiàn)，SMPD3在VSMCs分泌外泌體中起到重要作用，外泌體的分泌是對(duì)SMPD3的上調(diào)做出反應(yīng)，其釋放受到成骨刺激、細(xì)胞因子和生長因子的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。

細(xì)胞應(yīng)激對(duì)外泌體的釋放有影響，有研究表明細(xì)胞自噬與外泌體的釋放有關(guān)，對(duì)細(xì)胞自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)會(huì)影響外泌體的釋放，CD137-CD137配體信號(hào)通路可以通過Rab7分子調(diào)控VSMCs自噬從而影響外泌體的分泌[26]。激活VSMCs中CD137信號(hào)通路可以上調(diào)T細(xì)胞核因子C1在外泌體中的表達(dá)從而介導(dǎo)VSMCs鈣化[27]。體外高鈣環(huán)境可誘導(dǎo)SMPD3的表達(dá)促進(jìn)VSMCs分泌鈣化外泌體，該類外泌體具有MGP含量低、羥基磷灰石含量高的特點(diǎn)，從而將礦物沉積初始化為微鈣化。外泌體中的miR-204/miR-211介導(dǎo)了VSMC外泌體的旁分泌作用，經(jīng)褪黑素處理的VSMCs外泌體可以通過miR-204/miR-211以旁分泌、褪黑素-褪黑素膜受體依賴性作用方式減弱VSMCs的成骨分化和衰老[28]。在高血糖刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體中含有蛋白聚糖和Notch3，調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的鈣化/衰老[29]。其中Notch3在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路調(diào)節(jié)VSMCs的鈣化[30]。

五、展 望

血管鈣化與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，而VSMCs是參與血管鈣化的主要細(xì)胞，近年來對(duì)VSMCs外泌體的研究有利于進(jìn)一步揭示其參與調(diào)節(jié)鈣化的機(jī)制。在血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變或各種疾病狀態(tài)時(shí)，VSMCs產(chǎn)生應(yīng)激，多種信號(hào)通路激活引起外泌體分泌以及外泌體成分含量的變化，進(jìn)而促進(jìn)血管鈣化。VSMCs基因表達(dá)的改變以及鈣磷濃度等均會(huì)對(duì)外泌體參與鈣化產(chǎn)生影響。但VSMCs外泌體參與鈣化的具體機(jī)制和影響因子較為復(fù)雜，目前尚未完全明確，有待進(jìn)一步的研究完善。目前對(duì)外泌體參與血管鈣化的研究可以為臨床上如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈瘤形成、慢性腎臟疾病等疾病的預(yù)防和治療提供更好的靶點(diǎn)和新的治療策略。