Fusarium mangiferae對(duì)杧果酚類代謝的影響

柳鳳　歐雄常　詹儒林　韋繼光　常金梅

摘 要 為探討杧果感染畸形病過(guò)程中頂芽?jī)?nèi)酚類代謝的變化規(guī)律，以凱特杧為試驗(yàn)材料，測(cè)定了接種病菌（Fusarium mangiferae）后頂芽?jī)?nèi)總酚、類黃酮含量及酚類代謝相關(guān)酶（POD、PPO和PAL）活性的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明，接種病菌后杧果頂芽?jī)?nèi)總酚、類黃酮含量出現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，其峰值分別出現(xiàn)在接種病菌45 d和30 d，酚類代謝相關(guān)酶中PAL活性變化與總酚含量變化趨勢(shì)相同，POD和PPO活性在接種病菌后直線上升。F. mangiferae侵染對(duì)杧果酚類代謝產(chǎn)生顯著影響，可干擾杧果頂芽?jī)?nèi)總酚、類黃酮的含量變化，影響其相關(guān)酶活性，降低杧果對(duì)病菌的抵抗能力。杧果酚代謝紊亂失衡可能是病菌的重要致病機(jī)理之一。

關(guān)鍵詞 杧果畸形病；Fusarium mangiferae；侵染；酚類代謝

中圖分類號(hào) S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Effects of Fusarium mangiferae on Phenolic Metabolism in Mango

LIU Feng1，2， OU Xiongchang1， ZHAN Rulin1， WEI Jiguang2， CHANG Jinmei1

1 South Asia Tropical Crop Research Institute， CATAS， Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture，

Zhanjiang， Guangdong 524091， China

2 Agricultural Colleges， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China

Abstract In order to study the effect of pathogens causing malformation on phenolic metabolism in mango， we detected the changes of phenolics and flavonoids contents， peroxidase（POD）， phenylalanine ammonia-lyase（PAL）and polyphenol oxidase（PPO）activities in mango infected by Fusarium mangiferae. The results showed that， total contents of phenolics and flavonoids and activity of phenylalanine ammonia-lyase（PAL）were significantly increased in 45 days after inoculation，then decreased quickly， the activity of polyphenol oxidase（PPO）and peroxidase（POD）did not change obviously at the beginning after inoculation， then increased continuously. The pathogens could affect the phenolic metabolism in mango significantly， which related to its resistance reducing. The phenolic metabolism disturbances may be one of the important reasons about the disease occurs.

Key words Mango malformation； Fusarium mangiferae； Infection； Phenolic metabolism

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.025

酚類是植物抗病反應(yīng)的主要生化物質(zhì)，是一類苯環(huán)上含有一個(gè)或多個(gè)羥基的芳香族衍生物，能夠被逆境的生物和非生物因子誘導(dǎo)合成[1-2]。植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)代謝網(wǎng)是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程，酚類物質(zhì)可轉(zhuǎn)化為醌類和木質(zhì)素等其他抗性更強(qiáng)的物質(zhì)，間接提高植物的抗病性[3-4]。許多研究結(jié)果表明，酚類代謝在植物與病原生物互作過(guò)程中參與許多生理過(guò)程，如木質(zhì)化形成、氧化還原反應(yīng)、對(duì)毒素活性的反應(yīng)和刺激反應(yīng)等[5-6]。杧果畸形病是一種危害杧果正常生長(zhǎng)的世界性病害，植株感病后嫩葉變細(xì)而脆，嫩芽、花序簇生，最后干枯，因此杧果染病后幾乎不座果。國(guó)內(nèi)該病主要分布在云南、四川海拔較高的杧果晚熟地區(qū)[7-8]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于該病的研究主要集中在病原菌的生物學(xué)和分子生物學(xué)、地理分布、流行學(xué)、病原菌侵染寄主過(guò)程等方面，而有關(guān)病害的致病機(jī)理方面研究并不多。有研究報(bào)道病組織的形成與病原菌的毒素分泌和杧果內(nèi)源激素的失調(diào)有十分密切的關(guān)系[9]，但關(guān)于病原菌對(duì)杧果酚代謝影響目前還無(wú)人探討。本研究以我國(guó)杧果晚熟地區(qū)主栽品種“凱特”杧為材料，通過(guò)比較人工接種F. mangiferae后，健康與接種杧果內(nèi)酚類代謝的差異，旨在闡明F. mangiferae侵染對(duì)杧果酚類代謝的影響，豐富杧果畸形病病理的基礎(chǔ)理論，為進(jìn)一步研究病害發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制以及杧果畸形病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和設(shè)計(jì)

供試MG06菌株為杧果畸形病病原菌。以健康的一年生凱特杧實(shí)生苗為材料，采用組織塊接種法接種。將病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落邊緣打孔，取直徑0.8 cm的菌餅作為接種體。利用解剖刀在頂芽下1～2 cm處刺傷，將菌餅菌絲面貼于刺傷處，保濕培養(yǎng)。每間隔5 d接種1次，共接種5次。接種后0、15、30、45、60、75、90、105 d后取樣。每處理每次取15個(gè)芽，在液氮冷凍中磨成粉狀進(jìn)行混勻，分開(kāi)包裝后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 杧果體內(nèi)總酚含量測(cè)定 總酚的提取和含量參照林植芳等[10]的方法略作修改，具體如下：取0.5 g杧果頂芽粉狀物，立刻以含1% HCl的甲醇溶液提取，定容10 mL后，280 nm下測(cè)定吸光度值，以沒(méi)食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線加以計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.356 2x-0.004 1（R2=0.995 4）。

1.2.2 杧果體內(nèi)類黃酮含量測(cè)定 取2 g頂芽粉狀物，加入20 mL 60%的乙醇，25 kHz、800 W和40 ℃超聲波條件下提取1 h，過(guò)濾得濾液，殘?jiān)?jīng)超聲波再次浸提，過(guò)濾。合并兩次濾液，減壓蒸發(fā)濃縮使體積減半，用等量石油醚萃取，去除石油醚部分，將乙醇部分繼續(xù)減壓濃縮蒸干后，用10 mL甲醇定容，作為樣品提取液。取1 mL提取液，加入1 mL 1%三氯化鋁甲醇溶液，2 mL甲醇溶液，搖均靜止放置20 min，以甲醇作為空白，于274 nm下測(cè)定吸光度值。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物，具體測(cè)定方法同提取液，得到回歸方程為y=0.842 1x-0.005 2（R2=0.988 7）。

1.2.3 杧果體內(nèi)酚類代謝相關(guān)酶活性測(cè)定 POD、PAL和PPO活性測(cè)定參照張志良、李合生和高俊鳳等[11-13]的方法。

1.2.4 杧果頂芽?jī)?nèi)主要酚類含量測(cè)定

（1）色譜條件。色譜儀為島津（Shimadzu）高效液相色譜儀，包括LC-10ATvp高壓泵，SPD-10Avp檢測(cè)器，CTO-10ASvp柱溫箱，C-R8A積分儀；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.6%乙酸（50 ∶ 500 ∶ 450）；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相為1%冰乙酸水溶液（A液）和乙腈（B液），流速為1 mL/min，梯度洗脫程序：0～20 min（90%～65% A液，10%～35% B液），20～30 min（65% A液，35% B液），30～40 min（65%～90% A液，35%～10% B液），40～45 min（90% A液，10% B液）。

（2）酚含量測(cè)定。利用甲醇配制供試9種酚的標(biāo)準(zhǔn)液，適當(dāng)比例混合后得9種標(biāo)準(zhǔn)品混合液，按上述液相條件進(jìn)行檢測(cè)，采用峰面積外標(biāo)法定量測(cè)定，以濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，計(jì)算得到各標(biāo)樣的曲線方程和相關(guān)系數(shù)，具體見(jiàn)表1。取樣品總酚提取液2 mL，0.45 μm濾膜過(guò)濾后檢測(cè)供試9種酚的含量。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)的處理和分析均采用Microsoft Excel 2003 軟件及SPSS10.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和Duncans（鄧肯氏）多重差異比較，p<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種病原菌后杧果畸形病發(fā)病情況

將病原菌回接到杧果嫩梢上結(jié)果顯示， 45 d之后接種頂芽處形成大量凸起小芽包，75 d后凸起的芽包大量萌發(fā)，后期150 d萌發(fā)大量新芽，約是空白對(duì)照的7～9倍，且新葉細(xì)小生長(zhǎng)緩慢，與對(duì)照相比節(jié)間偏短，與典型的枝葉畸形相同（圖1）。

2.2 接種病原菌后杧果體內(nèi)總酚含量變化測(cè)定

杧果正常生長(zhǎng)期總酚含量保持在一個(gè)穩(wěn)定水平，約為1.35 mg/g FW。接種病原菌后杧果頂芽?jī)?nèi)總酚含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，如圖2所示。接種病原菌0～15 d內(nèi)，總酚含量直線上升，15～45 d處于頂峰狀態(tài)，約為2.45 mg/g FW，是相同時(shí)期對(duì)照處理的1.67倍。接種病原菌45 d后，總酚含量急劇降低，60 d后顯著低于對(duì)照處理，且隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚含量一直處于較低的水平，105 d時(shí)其含量?jī)H僅為對(duì)照處理的27.2%。

2.3 接種病原菌后杧果體內(nèi)類黃酮含量測(cè)定

病原菌侵染后杧果頂芽?jī)?nèi)類黃酮的含量與總酚呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，均為先上升后下降，但類黃酮的峰值出現(xiàn)在接種病原菌30 d時(shí)，類黃酮量為0.84 mg/g FW，是對(duì)照處理的1.74倍，接種病原菌30 d后其含量不斷降低，接種病原菌90 d后達(dá)到最低（圖3）。

2.4 接種病原菌后杧果體內(nèi)酚類代謝相關(guān)酶活性測(cè)定

POD可以催化松柏醇等木質(zhì)素前體的形成以及許多單酚、多酚和芳香烴的過(guò)氧化形成高毒性的酮等。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，PPO能催化酚氧化生成醌以及聚合形成的單寧類物質(zhì)。杧果感染病原菌后三者活性變化如圖4所示。POD活性在接種0～45 d內(nèi)快速上升，酶活力頂峰出現(xiàn)的時(shí)間是接種后第60天，后期酶活力略下降，但仍維持在較高的活性水平。PAL活性與類黃酮含量的變化趨勢(shì)基本一致，呈先上升后下降的趨勢(shì)，接種病原菌30 d時(shí)處于頂峰；PPO在接種病原菌45 d內(nèi)變化不明顯，隨后不斷上升，接種病原菌105 d后仍處于較高水平，約是對(duì)照處理的2.14倍。

2.5 病健杧果頂芽主要酚類含量差異分析

以沒(méi)食子酸、肉桂酸等9種酚為檢測(cè)對(duì)象，比較接種病原菌后杧果頂芽?jī)?nèi)酚含量的差異情況，結(jié)果如表2所示。供試的9種酚中楊梅酸和白藜蘆醇在試驗(yàn)階段無(wú)明顯變化；沒(méi)食子酸、蘆丁、槲皮素、肉桂酸和反肉桂酸在接種病原菌45 d時(shí)均有不同程度的升高，但接種病原菌105 d時(shí)均顯著低于對(duì)照處理。其中綠原酸、肉桂酸和反肉桂酸變化量最大，接種病原菌45 d時(shí)分別是對(duì)照處理的2.84、2.12和2.44倍。

3 討論與結(jié)論

植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)通過(guò)抑菌和殺菌作用、鈍化毒素、去除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用等方式參與植物的抗病反應(yīng)[1]。反之，病原菌侵染植物時(shí)，必然也在一定程度上影響到植物體內(nèi)原有的酚類代謝平衡[8]。在有關(guān)病原物與植物互作的研究中，植物能否抵抗住病原菌的侵染在一定程度上取決于酚類物質(zhì)的合成速度和保持高濃度的時(shí)間[4，14]。研究結(jié)果表明，抗病品種受植物侵染后組織內(nèi)酚類物質(zhì)迅速積累且較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持在高峰狀態(tài)，而感病品種在感病初期酚類物質(zhì)積累慢進(jìn)而不能有效地阻止病原菌的侵入。Prats等[15]研究發(fā)現(xiàn)向日葵體內(nèi)酚類物質(zhì)的含量與其抗性水平、接種時(shí)間和取樣部位存在一定的相關(guān)性，抗病品種內(nèi)酚類物質(zhì)總量顯著高于感病品種和未接種處理，且提取的酚類物質(zhì)對(duì)核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。因此可以認(rèn)為只有當(dāng)酚類物質(zhì)的濃度達(dá)到足夠的量并長(zhǎng)久維持，才能對(duì)病原菌有明顯的抑制和阻礙作用[16-17]。PAL是苯丙烷代謝途徑中酚類、植保素和木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，一般認(rèn)為PAL活性的增強(qiáng)對(duì)植物抗病是有利的。PPO能夠使酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈叨拘缘孽愇镔|(zhì)，對(duì)病原物果膠分解酶等活性具有強(qiáng)烈的抑制作用[18]。郭紅蓮等[19]研究了玉米灰斑病菌（Cercosporazeae maydis）侵染4個(gè)玉米品種前后PAL、POD、PPO及木質(zhì)素含量的變化，3種酶的活性在抗感病品種中碼，隨著病原菌的侵染都發(fā)生了明顯的變化。Mikulic-Petkovsek等[20]利用HPLC-MS分析了辣椒受炭疽菌感染后其體內(nèi)酚類物質(zhì)的種類與及其含量變化的情況，并評(píng)估了酚類物質(zhì)在寄主防御機(jī)制中的作用，研究發(fā)現(xiàn)，在健康組織、感病組織和病健交界區(qū)共檢測(cè)到21種酚類物質(zhì)，其中芹菜素、槲皮素、藤黃菌素、綠原酸和金圣草素等含量較多。在病健交界區(qū)，槲皮素、藤黃菌素、綠原酸和金圣草素的含量顯著高于健康組織，而芹菜素含量與健康組織無(wú)明顯差異，由此推斷，芹菜素在辣椒的防御體制中作用不明顯，病健交界區(qū)強(qiáng)烈的酚類物質(zhì)合成能力促進(jìn)了其體內(nèi)酚類物質(zhì)總量不斷上升，進(jìn)而阻礙了病原菌的進(jìn)一步蔓延[20]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，酚類物質(zhì)與杧果抗畸形病有著較密切的關(guān)系，接種病原菌45 d后，總酚含量和PAL活性迅速提高是相同時(shí)期對(duì)照處理的2倍左右，表明酚類代謝參與杧果的抗病反應(yīng)，是杧果對(duì)病原菌侵染的應(yīng)激反應(yīng)之一。接種病原菌后期，F(xiàn). mangiferae成功侵染杧果，頂芽?jī)?nèi)的正常代謝途徑發(fā)生紊亂，杧果體內(nèi)總酚含量及PAL活性急速下降，失去了對(duì)病原菌的阻礙和抑制作用，因而引發(fā)了病害的產(chǎn)生。本研究只是初步探討了POD、PAL、PPO及酚類物質(zhì)與抗病性的相關(guān)性，對(duì)其他抗病因子如植保素和一些抗原蛋白及誘發(fā)抗菌物質(zhì)的其他酶類如ATPase等也應(yīng)進(jìn)行廣泛和深入的探討。由研究結(jié)果可以推測(cè)，PAL和酚類含量可能是杧果抗畸形病的鑒定指標(biāo)，因而充分利用這些生化因子來(lái)進(jìn)行下一步的研究工作，探索不同品種的杧果對(duì)F. mangiferae抗性機(jī)制的差異，可以為以后的抗病育種工作打下理論基礎(chǔ)。

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