組織培養(yǎng)結合秋水仙素誘導南瓜多倍體

閔子揚 童龍 楊紅波 李涵 成娟 張瓊 謝向陽 孫小武

摘 要： 以‘紅栗2號南瓜子葉為外植體，探討外植體消毒時間、激素組合和培養(yǎng)基中秋水仙素濃度對芽誘導率的影響，對所得植株的倍性進行鑒定。結果表明：外植體在3%（w） NaClO溶液中消毒15 min，污染率為0且外植體活力較高;MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+秋水仙素40 mg·L-1是誘導‘紅栗2號南瓜產生四倍體的最適培養(yǎng)基，誘導率達到25.71%;組培苗形態(tài)及根尖染色體有四倍體存在。

關鍵詞： 南瓜; ‘紅栗2號; 組織培養(yǎng); 秋水仙素; 誘導; 四倍體

Study on polyploid induction of pumpkin by tissue culture combined with colchicines

MIN Ziyang1， TONG Long1， YANG Hongbo1，2， LI Han1，CHENG Juan1， ZHANG Qiong1，2， XIE Xiangyang2， SUN Xiaowu1，2

（1. Hunan Agricultural University， Changsha， 410128， China; 2. Hunan Province Melon Research Institute， Shaoyang， 422001， China）

Abstract：The cotyledon of pumpkin-‘Hongli 2is used as explant to study the influence of disinfect time，hormone combination and different concentrations of colchicine of medium on bud induction rate. ?The ploidy of regenerated plant is also identified .The results showed that the explants disinfect in 3% Naclo solution for 15 min，the pollution rate can be reduced to zero and the explants showed higher activity. MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+colchicine 40 mg/L was the optimal medium to induce ‘Hongli 2to generate tetraploid. The bud induction rate was up to 25.71%. The observation of somaclone form and root tip chromosomes showed the existence of tetraploid.

Key words： Pumpkin; ‘Hongli No. 2; Tissue culture; Colchicine; Induction; Tetraploid

南瓜是葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita）中的一年生草本植物，起源于中、南美洲，栽培種及野生近緣種共有 30 個，其中有5個南瓜栽培種，而在我國栽培的主要有 3 個：南瓜（Cucurbita moschata Dvch.）又名中國南瓜、筍瓜（C. maxima D.）又名印度南瓜、西葫蘆（C. pepo L.）又名美洲南瓜。南瓜栽培歷史悠久，適應性強，種植面積大，具有世界性蔬菜的美稱，不僅產量高、耐貯藏，而且南瓜營養(yǎng)價值十分豐富，富含胡蘿卜素、戊聚糖、果膠、甘露醇、葫蘆巴堿、腺嘌嶺、礦質元素等多種營養(yǎng)成分，其中所含的一些藥用成分對多種疾病均有療效，尤其是南瓜多糖，是預防糖尿病的活性成分，受到國內外的關注[1-2]。然而，我國南瓜的優(yōu)良品種類型少，品種更新?lián)Q代慢，并且隨著近年來生產面積的不斷擴大，規(guī)?；N植和連作障礙，南瓜病害有逐年加重的趨勢，尤其是針對南瓜的主要病害如疫病、白粉病、病毒病等的抗病性研究嚴重滯后于生產。

與正常倍性植株相比多倍體植株一般表現(xiàn)出營養(yǎng)物質更加豐富，貯運性更好并且具有較強的抗病性和抗逆性等特點，所以越來越受到育種工作者的關注。利用組織培養(yǎng)與秋水仙素相結合獲得四倍體植株是多倍體育種的一個重要途徑，這已經在西瓜[3]和甜瓜[4]等瓜類作物的多倍體育種中得到了應用，但是在南瓜上的相關報道還比較少。本文通過對組織培養(yǎng)和秋水仙素相結合的方法誘導南瓜四倍體的研究，為南瓜新品種的選育提供理論依據(jù)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為‘紅栗2號南瓜種子，由湖南省瓜類研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得 選取籽粒飽滿、大小均勻一致的‘紅栗2號南瓜種子，剝去種殼，在25 ℃ 的恒溫水中浸種5～6 h。在超凈工作臺上用75%（φ） 的酒精表面消毒30 s后用無菌水沖洗3遍，然后置于3%（w）的NaClO溶液中分別消毒9、12、15、18 min以觀察不同消毒時間對無菌苗萌發(fā)的影響，消毒期間要不停搖動，然后用無菌水沖洗5～6次，將消毒過的種子放在無菌濾紙上吸干表面的水分后接種到不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)，待種子發(fā)芽后轉入光下培養(yǎng)，光照周期為16 h·d-1，光強2 500 lx，整個培養(yǎng)期間一直處于（25±1）℃ 的溫度條件下。試驗中每處理接種3瓶，每瓶接種6個外植體，重復3次。

1.2.2 外植體的切取和不同激素組合對芽誘導的影響 以‘紅栗2號南瓜剛轉綠2 d的子葉為外植體，在取用子葉時，去掉子葉邊緣部分后將剩下的橫切為二，再取其近葉柄端[5]縱切為二，每片子葉得到2塊約3 mm×5 mm的外植體。將從子葉上切取的外植體正面朝上接種到添加不同質量濃度的6-BA（2.0、3.0、4.0 mg·L-1）和NAA（0.1、0.2 mg·L-1）激素組合的MS培養(yǎng)基中進行芽誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照16 h·d-1，光強2 500 lx、溫度（25±1）℃，25 d后觀察統(tǒng)計不同激素濃度組合對芽誘導率的影響。試驗中每種激素組合接種3瓶，每瓶接種4個外植體，重復3次。

1.2.3 培養(yǎng)基中秋水仙素濃度對‘紅栗2號四倍體誘導效果的影響 在1.2.2中篩選的最適南瓜芽誘導培養(yǎng)基的基礎上，將切取的外植體分別接種在添加不同濃度秋水仙素的芽誘導培養(yǎng)基上，秋水仙素質量濃度分別為20、30、40、50、60、70 mg·L-1，同時以未添加秋水仙素的最適芽誘導培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)條件為光照16 h·d-1，光強2 500 lx、溫度（25±1℃），25 d后觀察統(tǒng)計不同秋水仙素濃度對芽誘導率及成活率的影響。試驗中每個處理接種3瓶，每瓶接種4個外植體，重復3次。

1.2.4 不定芽的生根培養(yǎng) 參照任桂紅、林榮[6]的方法，將長至2 cm左右的不定芽轉接到MS+NAA 1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基中誘導不定芽生根以形成完整植株。

1.2.5 多倍體植株的鑒定 （1）形態(tài)學鑒定：對所得植株外觀進行觀察，并且與正常植株相比較，觀察指標包括植株高度、莖粗度、葉片大小、葉片厚度、葉片顏色。（2）根尖染色體計數(shù)鑒定：在陳解放[7]的關于南瓜根尖染色體計數(shù)方法的基礎上稍作改進，將解離時間調整為10 min，卡寶品紅染色液染色時間增加到15 min，其他不變，以此來觀察所得植株根尖的染色體倍性組成。

2 結果與分析

2.1 消毒時間對種子萌發(fā)的影響

在組織培養(yǎng)的過程中，外植體的消毒是最基礎也是最重要的步驟，消毒情況的好壞嚴重影響著試驗的進程，所以獲得污染率較低且活力較高的外植體是至關重要的。本試驗中先用75% 的酒精處理30 s然后用3% 的NaClO溶液處理不同的時間，其對種子萌發(fā)的影響見表1。

表1 NaClO不同處理時間對種子萌發(fā)的影響

[消毒時間

/min＼&外植體數(shù)量

/個＼&萌芽數(shù)量

/個＼&污染數(shù)量

/個＼&污染率

/%＼&萌芽率

/%＼&9

12

15

18＼&18

18

18

18＼&15.33

15.00

13.67

9.67＼&8.33

3.33

0.00

0.00＼&46.28 a

18.50 b

0.00 c

0.00 c＼&85.17 a

83.33 b

75.94 c

53.72 d＼&]

[注] 不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。后表同。

從表1可以看出：消毒效果與消毒時間的長短有密切關系，當消毒時間只有9 min的時候污染率達到46.28%，隨著消毒時間的延長，消毒效果逐漸增強，當消毒時間達到15 min的時候污染率為0。但是，隨著消毒時間的增加NaClO對種子的毒害作用越來越強，當消毒時間為18 min的時候種子的萌芽率只有53.72%。從表中可以看出消毒時間18 min與消毒15 min相比污染率都為0，但種子萌芽率降低了22.22百分點，所以消毒15 min是較適宜的處理時間。在試驗中還發(fā)現(xiàn)，隨著消毒時間的延長不但外植體的萌芽率降低，而且萌芽的外植體畸形率也隨之提高，具體表現(xiàn)為下胚軸不伸長或稍微伸長，子葉扭曲或子葉呈白化狀無法轉綠。

2.2 不同激素組合對芽誘導率的影響

外源激素是誘導子葉產生不定芽所必需的物質，不同激素配比決定著芽誘導率的高低。本試驗中不同激素配比對不定芽誘導的效果見表2。

從表2可以看出，當NAA濃度一定時隨著6-BA濃度的增加，芽分化率逐漸提高，最高可達到44.42%;當6-BA濃度一定時隨著NAA濃度極小幅度的增加，芽分化率急劇下降，說明低濃度的NAA能有效地誘導芽的分化而高濃度的NAA卻抑制芽的分化。當NAA濃度為0.1 mg·L-1，6-BA濃度為3.0 mg·L-1或4.0 mg·L-1的時芽誘導率沒有明顯差異，但是在3.0 mg·L-1時誘導出的芽生長狀況良好（圖版—a），而在4.0 mg·L-1的時誘導出的芽有較多畸形芽存在（圖版—b）。綜合評價認為MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1是誘導南瓜子葉形成不定芽的最適培養(yǎng)基。

2.3 培養(yǎng)基中秋水仙素濃度對‘紅栗2號四倍體的誘導效果

在正常的誘導培養(yǎng)基中加入適宜濃度的秋水仙素來誘導四倍體芽（包埋法）能顯著提高四倍體的誘導率，這已經在其他種類的瓜類作物上得到了驗證，本試驗在他人的研究成果上采用“包埋法”對‘紅栗2號南瓜子葉進行了四倍體誘導，具體情況見表3。

由表3可知：隨著秋水仙素濃度的提高，死亡外植體數(shù)目逐漸增加，當秋水仙素達到70 mg·L-1時外植體全部死亡;在低濃度秋水仙素（0～40 mg·L-1）條件下芽分化率差別不大，但是當其濃度大于40 mg·L-1時秋水仙素對外植體的毒害作用明顯加強導致芽誘導率急劇下降;四倍體芽的出現(xiàn)率跟秋水仙素的濃度密切相關，在低濃度下出現(xiàn)率為0，在適宜的濃度范圍內隨著秋水仙素濃度的提高四倍體芽的出現(xiàn)率也隨之提高，在40 mg·L-1時達到最大值25.71%，但是超過適宜濃度以后秋水仙素對生長的抑制作用明顯加強，導致四倍體誘導率降低。綜上所述認為MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+秋水仙素40 mg·L-1是誘導‘紅栗2號南瓜產生四倍體的最適培養(yǎng)基（圖版—c）。

2.4 不定芽的生根效果

將長至2 cm左右的不定芽轉接到MS+NAA 1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基上，很容易誘導不定芽生根以形成完整植株，在誘導生根培養(yǎng)基中15 d以后生根率達到98%（圖版—d）。

2.5 植株的倍性鑒定

2.5.1 形態(tài)學鑒定 在植株形成以后對其外部形態(tài)進行觀察以大致了解其倍性構成情況，對比正常二倍體組培苗（圖版—e）觀察發(fā)現(xiàn)有一些植株高度較高，莖明顯增粗，葉片稍微變小，葉片厚度增加，表現(xiàn)出四倍體植株的形態(tài)特征（圖版—f）。

2.5.2 根尖染色體計數(shù) 分別取正常二倍體組培苗根尖和表現(xiàn)出四倍體形態(tài)特征的組培苗根尖進行染色體計數(shù)，結果表明，表現(xiàn)出四倍體形態(tài)特征的組培苗染色體數(shù)目大于44條（圖版—g），而正常二倍體植株染色體數(shù)目為44（2n=2x=44）條（圖版—h）。試驗過程中誘導得到了組培苗（圖版—i）。

3 討論與結論

外植體消毒完成以后表面會殘留一些水分，試驗過程中發(fā)現(xiàn)如果不用無菌濾紙吸干表面的水分而是直接進行無菌苗的誘導，污染率將大幅上升，吸干表面水分以后接種就可以得到有效的改善，這可能是因為外植體表面有大量水分存在的情況下，微生物更容易繁殖。

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，經誘導培養(yǎng)基誘導出的叢生芽在后續(xù)發(fā)育的過程中不易伸長生長，表現(xiàn)出老小苗現(xiàn)象，將叢生芽切成單芽轉接培養(yǎng)后單芽容易死亡，這可能是由于芽體內激素水平不平衡的緣故。

秋水仙素有劇毒，在組織培養(yǎng)的過程中對外植體有毒害作用，明顯抑制不定芽的分化甚至導致外植體死亡，這與鄭永強、徐坤的結論相同[8]。另一方面，秋水仙素在誘導四倍體植株產生的過程中又是必不可少的能顯著提高誘變率，后面可以進一步研究有沒有物質能夠在不影響秋水仙素誘導效果的前提下降低其毒害作用或尋找秋水仙素的替代誘變劑，這對以“混培法”來誘導多倍體的產生至關重要。

南瓜根尖染色體數(shù)目較多，形態(tài)較小，壓片時不易分散，并且組培苗的根大多部分木質化不易解離所以觀察起來費時費力，后面試驗的過程中要進一步研究多倍體植株的形態(tài)跟倍性之間的關系，爭取在植株生長前期就可以大致確定植株的倍性構成情況，這對后續(xù)的工作具有指導意義。

‘紅栗2號南瓜以子葉為外植體在秋水仙素存在的情況下通過組織培養(yǎng)的方式誘導四倍體植株的產生具體步驟如下：選取籽粒飽滿、大小均勻一致的‘紅栗2號南瓜種子，剝去種殼，在25 ℃ 的恒溫水中浸種5～6 h后在超凈工作臺上用75%（φ）的酒精表面消毒30 s然后置于3%（W）的NaClO溶液中消毒15 min，無菌濾紙吸干表面水分后接種到不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)4 d后光照培養(yǎng)，子葉轉綠后切取近葉柄端轉接到MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+秋水仙素40 mg·L-1的培養(yǎng)基上誘導芽的形成，待芽長至2 cm左右后轉接到MS+NAA 1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基上誘導生根，最后對誘導出的植株進行形態(tài)學和細胞學鑒定，以確定是否為四倍體植株。

參考文獻

[1] ? ?陳智民，王修梅. 南瓜粉降血糖、降血壓作用的人體研究[J]. 江西中醫(yī)藥，1994，25（2）： 50.

[2] ? ?熊學敏，葉士玲. 南瓜多糖對四氧嘧啶糖尿大鼠的降糖果作用[J]. 江西中醫(yī)學院學報，1998，10（4）： 174-175.

[3] ? ?Compton M E，Gray D J. Shoot organogenesis and plant regeneration from Cotyledons of diploid，triploid and tetraploid watermelon[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，1993，118（1）：151-157.

[4] ? ?Ezura H， Amagai H，Yoshioka K，et al . Efficient production of tetraploid melon（Cucumis melo L.）by somatic embryogenesis[J]. Japanese Journal of Breeding，1992，42（1）： 137-144.

[5] ? ?趙建萍，艾西絲. 南瓜子葉的離體培養(yǎng)[J]. 園藝學報，1999，26（3）：196-197.

[6] ? ?任桂紅，林 ? 榮. 南瓜子葉再生體系的建立[J]. 北方園藝，2010（23）： 133-135.

[7] ? ?陳解放. 南瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)體系的優(yōu)化[D]. 鄭州：河南農業(yè)大學，2010.

[8] ? ?鄭永強，徐 ? 坤. 秋水仙素在植物體細胞染色體加倍中的應用研究進展[J]. 中國農學通報，2003，19（5）： 89-91.