胃泌素及胃泌素受體基因在胃癌和癌前病變組織中的表達(dá)*

謝 淵，趙 艷，劉正美，官志忠，周建獎(jiǎng)

(貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Trizol(美國(guó)Invitrogen 公司)，Oligo dT18 及dNTPs(大連寶生物工程有限公司)，SYBR Green Mix(美國(guó)ABI 公司)，MMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑(美國(guó)Promega 公司)，SYBR Green QPCR Master Mix(美國(guó)ABI 公司)，Step-one plus 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI 公司)。GAS、CCK-BR 及內(nèi)參次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferas1，HPRT1)引物由上海生工生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2 胃組織

收集2013 年1 月～2014 年12 月行胃鏡檢查并經(jīng)病理確診為胃癌及癌前病變的胃組織標(biāo)本共51 例，所有標(biāo)本均得到患者知情同意和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。其中23 例慢性萎縮性胃炎組織、12例腸上皮化生組織、4 例非典型增生組織及12 例胃癌組織，所取胃組織患者男性23 例，女性25 例，年齡30 ～89 歲。組織標(biāo)本采集后分別加入1 mL RNA 保護(hù)液，－85 ℃保存待用。

1.3 GAS、CCK-BR mRNA 表達(dá)

運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)Trizol-酚－氯仿一步法提取各胃組織總RNA，用RNA 純化柱純化RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA 含量，A260/A280 鑒定RNA 純度。取2 000 ng 總RNA 加入10 μmol/L Oligo(dT)181 μL，混勻后65 ℃水浴5 min，加入10 μmol/L dNTPs 2.5 μL、5×緩沖液5 μL、200 U/μL MMV 1 μL、40 U/μL RNA 酶抑制劑0.5 μL、DEPC 水補(bǔ)足體積至25 μL，42 ℃60 min，95 ℃5 min，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，－20 ℃保存?zhèn)溆?。以各組胃組織cDNA為模版，在A(yíng)BI Step-one plus 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測(cè)GAS、CCK-BR 和內(nèi)參HPRT1 基因的表達(dá)，反應(yīng)條件為95 ℃10 min，95 ℃15 s、60 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)。將各目的基因的熒光信號(hào)進(jìn)行收集、分析，以胃癌組織為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量2－ΔΔCt，ΔΔCt=(Ct目的基因－CtHPRT1)處理組－(Ct目的基因－CtHPRT1)標(biāo)準(zhǔn)，用融解曲線(xiàn)監(jiān)測(cè)各樣本PCR 反應(yīng)的特異性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RNA 的純度

提取的胃組織RNA A260/A280值為1.8 ～2.0，濃度為400 ～800 g/L，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RNA 中的28s rRNA、18s rRNA 清晰可見(jiàn)，表明提取的RNA 質(zhì)量較好，見(jiàn)圖1。

圖1 胃組織提取的RNA 電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of RNA extracted from gastric tissues

2.2 GAS 和CCK-BR 基因擴(kuò)增的特異性監(jiān)測(cè)

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 熔解曲線(xiàn)分析目的基因GAS、CCK-BR 和內(nèi)參基因HPRT1 擴(kuò)增特異性，結(jié)果3 個(gè)基因的熔解曲線(xiàn)均為特異性單峰，無(wú)引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，表明擴(kuò)增的特異性好，見(jiàn)圖2。

圖2 目的基因熒光定量PCR 擴(kuò)增熔解曲線(xiàn)Fig.2 Gene fluorescence quantitative PCR amplification and melting curve diagram

2.3 GAS 和CCK-BR mRNA 表達(dá)水平

GAS 及其受體CCK-BR 在各類(lèi)患者胃組織中均有表達(dá)，在慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、非典型性增生患者胃組織中，GAS 和CCK-BR 的表達(dá)均高于胃癌患者(P ＜0.05)，GAS 為胃癌組患者的2.37、1.67 及1.9 倍，CCK-BR 為胃癌組患者的1.62、3.66、1.33 倍。見(jiàn)表2 和表3。

表2 胃癌及癌前病變胃組織中GAS mRNA 的表達(dá)Tab.2 Expression of the gastrin mRNA in gastric cancer and precancerous tissue

表3 胃癌及癌前病變胃組織CCK-BR mRNA 的表達(dá)Tab.3 Expression of the CCK-BR mRNA in gastric cancer and precancerous tissue

3 討論

胃癌是危害人類(lèi)健康的主要惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分別占全部腫瘤的第5 位和第3位［4］。研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞能自分泌GAS，作為生長(zhǎng)因子與癌細(xì)胞上CCK-BR 結(jié)合，形成自分泌環(huán)，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，在胃癌的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)程中起重要作用［5］。

本次研究發(fā)現(xiàn)GAS 及其受體CCK-BR 在胃癌和癌前病變組織中都有表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了胃癌細(xì)胞能自分泌GAS，作為生長(zhǎng)因子與癌細(xì)胞上CCKBR 結(jié)合，形成自分泌環(huán)，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAS 在慢性胃炎、腸上皮化生、非典型性增生組的表達(dá)均高于胃癌組，分別為胃癌組的2.37、1.67、1.9 倍，與唐卓斌［6］，王麗等［7］研究結(jié)果較為一致。GAS 主要由胃竇G 細(xì)胞分泌產(chǎn)生，在胃癌組的表達(dá)低于癌前病變組，可能與癌組織G細(xì)胞數(shù)目減少有關(guān)。劉錦濤等［8］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淺表性胃炎時(shí)G 細(xì)胞無(wú)明顯變化，萎縮性胃炎G 細(xì)胞密度明顯減低，嚴(yán)重萎縮的胃黏膜G 細(xì)胞消失，腸化組織中G 細(xì)胞甚少或缺如，胃竇癌組織中無(wú)G 細(xì)胞。Winslow JL［9］認(rèn)為G 細(xì)胞計(jì)數(shù)是反映慢性萎縮性胃炎，特別是腸化嚴(yán)重程度的一項(xiàng)可靠指標(biāo)，降低到正常值1/3 時(shí)，可能是演變?yōu)槲赴┑呐R界點(diǎn)。本研究結(jié)果中GAS 的表達(dá)變化沒(méi)有隨病程變化而遞減，分析可能是此次實(shí)驗(yàn)中所收集到非典型增生組織標(biāo)本過(guò)少，造成統(tǒng)計(jì)上有一定偏移的原因。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)消化道腫瘤細(xì)胞膜上亦表達(dá)CCKBR，在體和離體實(shí)驗(yàn)表明，GAS 對(duì)CCK-BR 陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞株具有刺激生長(zhǎng)的作用，停用GAS 后這種促增殖作用消失，而應(yīng)用CCK-BR 拮抗劑能抑制細(xì)胞的增殖，說(shuō)明這種增殖作用是通過(guò)CCK-BR 而發(fā)揮作用的［10］。還有很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者胃癌組織中CCK-BR 的含量明顯高于對(duì)照正常組織，CCK-BR 廣泛參與胃癌發(fā)生發(fā)展［11－12］。但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性胃炎、腸上皮化生、非典型性增生組CCK-BR 表達(dá)均高于胃癌組，分別為胃癌組的1.62、3.66、1.33 倍。分析發(fā)現(xiàn)CCK-BR 表達(dá)并未隨著胃癌病程的發(fā)展逐漸降低，未見(jiàn)一致性，但與GAS 的表達(dá)卻有一定的一致性。因此認(rèn)為CCK-BR表達(dá)與胃癌的關(guān)系是可能是通過(guò)介導(dǎo)胃泌索促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)刺激作用而實(shí)現(xiàn)，與CCK-BR 受體本身的表達(dá)量相關(guān)性不大。

［1］Wu AW，Ji JF，Yang H，et al.Long-term outcome of a large series of gastric cancer patients in China［J］.Chinese Journal of Cancer Research，2010(3):167－175.

［2］曾怡，周建獎(jiǎng)，謝淵，等.沉默胃泌素基因抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2014(9):905－911.

［3］劉駿，謝淵，趙艷，等.胃泌素促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013(4):730－733、738.

［4］Jin YP，Lawrence von K，Rolando H.Prevention Strategies for Gastric Cancer:A Global Perspective［J］.Endoscopic Screening and Surveillance for Gastrointestinal Cancer，2014(47):478－489.

［5］王春云，鄭侃侃，謝文彪.胃泌素及其受體與胃癌關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際外科學(xué)雜志，2014(7):490－493.

［6］唐卓斌，劉為紋.胃黏膜癌變過(guò)程中胃泌素生長(zhǎng)抑素蛋白表達(dá)及其意義［J］.中華消化雜志，2001(21):393－394.

［7］王麗，周麗雅.胃泌素在胃炎與胃癌中表達(dá)的差異及意義［J］.中國(guó)微創(chuàng)外科雜志，2011(11):435－436.

［8］劉錦濤，楊建榮，葉平，等.胃竇部G 細(xì)胞與消化性潰瘍和胃癌關(guān)系的探討［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2003(4):403.

［9］Winslow JL，Trainer TD，Colletti RB.Collagenous gastritis:a long-term follow-up with the development of endocrine cell hyperplasia，intestinal metaplasia，and epithelial changes indeterminate for dysplasia［J］.Am J Clin-Pathol，2001(5):753－758.

［10］李孟軍，黃廣建，樂(lè)竹琴，等.胃癌及鄰近黏膜表達(dá)胃泌素受體的差異及其意義［J］.中華胃腸外科雜志，2001(1):50－54.

［11］黃亞娜，唐世孝.胃泌素與胃癌關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.西南軍醫(yī)，2012(5):757－760.

［12］Rai R，Chandra V，Tewari M，et al.Cholecystokinin and gastrin receptors targeting in gastrointestinal cancer［J］.Surg Oncol，2012(4):281－292.