放療聯(lián)合抑制STAT3表達對惡性B細胞免疫原性分子表達的影響

放療聯(lián)合抑制STAT3表達對惡性B細胞免疫原性分子表達的影響*

通信作者 E-mail:842031616@qq.com

網(wǎng)絡出版時間：2015-10-13網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20151013.1145.006.html

張啟芳1， 禹文峰1， 吳昌學1， 官志忠1， 柏華2**

(1.貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學 第三附屬醫(yī)院 醫(yī)學實驗中心， 貴州 都勻558000)

[摘要]目的： 研究放療聯(lián)合抑制信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)表達對惡性B細胞免疫原性的影響。方法： 在BALB/c小鼠大腿皮下接種小鼠惡性B細胞淋巴瘤表達GFP的A20細胞形成腫瘤，在腫瘤內(nèi)注射STAT3基因特異的shRNA質(zhì)粒并進行放療；采用熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)和免疫印跡法(Western blot)方法分別檢測腫瘤組織中STAT3 mRNA和蛋白表達水平；細胞膜蛋白分子染色法檢測惡性B細胞表面分子MHCII、CD40和CD80的表達，用流式細胞儀收集細胞染色數(shù)據(jù)。結果： 放療聯(lián)合抑制STAT3表達能顯著降低STAT3 mRNA和蛋白表達水平， 與單純放療比較，放療聯(lián)合抑制STAT3表達治療顯著增加A20細胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論： 放療聯(lián)合抑制STAT3表達能增強決定惡性B細胞免疫原性的分子表達。

[關鍵詞]信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3； 放射療法； 淋巴瘤,B細胞； 聚合酶鏈式反應； 免疫印跡； 流式細胞術

[基金項目]*國家自然科學

[中圖分類號]R730.5; R733.4; R34-33[文獻標識碼] A

The Effect of Combination of Radiotherapy with Abrogating STAT3

Activity on the Maturation of Malignant B-cell Lymphoma Cells

ZHANG Qifang1, YU Wenfeng1, WU Changxue1, GUAN Zhizhong1, BAI Hua2

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Medical

ExperimentalCenter,ThirdAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Duyun558000,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To examine the effect of combination of radiotherapy with STAT3 inhibition on the immunogenicity of malignant B-cell Lymphoma Cells. Methods: Murine A20 B cell lymphoma cells were subcutaneously injected the thighs of BALB/c mice to form tumors. Tumors were given intratumor injection of STAT3 shRNA plasmid and local radiotherapy. STAT3 expression in tumors was determined by qPCR at mRNA levels and by Western blot at protein levels. The expression of MHCII, CD40 and CD80 were determined by extracellular staining and subsequent data collected by flow cytometry. Results: STAT3 expressions were remarkably silenced in tumors. Compared to radiotherapy alone, radiotherapy combined with STAT3 silencing significantly upregulated the expression of MHCII, CD40 and CD80 on A20 cells.Conclusions: Radiotherapy plus STAT3 silencing increases the expression of molecules that decide the immunogenicity of malignant B cell lymphoma.

[Key words] signal transducer and activator of transcription 3; radiotherapy; lymphoma, B cell; polymerase chain reaction; western blot; flow cytometry

套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)是B細胞非霍奇金淋巴惡性腫瘤的一個獨特亞型，約占淋巴瘤的5%~10%。目前治療淋巴瘤多采用化療聯(lián)合妥昔單克隆抗體方案，其次為造血干細胞移植[1-3]。這些治療雖然可以緩解患者的病情，但多數(shù)無法治愈，最終會復發(fā)[4-5]。臨床急需探尋一種新的治療方案以提高患者的整體生存率。有研究發(fā)現(xiàn)把耐受性抗原呈遞細胞轉(zhuǎn)換為能夠觸發(fā)有效的T細胞、反應炎性抗原呈遞細胞及增強惡性B細胞的免疫原性，起到抵抗淋巴瘤的作用[6-8]。滿足上述要求的治療策略可能不僅能成功消滅B細胞腫瘤，還可能給機體提供更長久的免疫力，避免腫瘤復發(fā)。本研究在BALB/c小鼠大腿皮下接種小鼠惡性B細胞淋巴瘤A20細胞形成腫瘤，利用放療大量殺死腫瘤細胞，利用免疫原性細胞，誘導機體發(fā)生免疫反應，同時抑制信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)表達，探討放療聯(lián)合抑制STAT3表達對惡性B細胞的免疫原性的影響。

1材料與方法

1.1　試劑

小鼠惡性B細胞淋巴瘤A20細胞購自美國ATCC公司 ，STAT3探針購自Universal Probe Library(UPL)，兔抗STAT3(sc-8019)、羊抗β-actin (sc-1616)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(ZB-2301)、兔抗羊二抗 (ZB-2306) 購自美國Santa Cruz公司，熒光標記抗體主要組織相容性復合體(MHC)II、CD40、CD80購自美國eBiosciences，胎牛血清、1x Antibiotic-Antimycotic、1640培養(yǎng)液購自Gibco公司，RNeasy Plus kit 購自Qiagen公司，cDNA合成試劑盒(iScript)購自Bio-Rad公司。

1.2　方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及處理把實驗前期表達熒光GFP的陽性的A20細胞(A20.GFP)放于含10%胎牛血清和1×Antibiotic-Antimycotic的RPMI 1640培養(yǎng)液，5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2小鼠帶瘤實驗 在100 μL 1×PBS中制備含5×106的 A20.GFP細胞懸浮，并接種于BALB小鼠大腿皮下。根據(jù)公式V=L×W2/2計算腫瘤體積(V為體積，L為瘤體的長，W為寬)。待瘤塊長至約150 mm3時，隨機分為3組，每組6只，分別為PBS組、放療+空質(zhì)粒組(RT+empty)、放療+shRNA (RT+shRNA)組，放療前瘤內(nèi)注射STAT3基因特異shRNA質(zhì)粒1次，腫瘤處放療10 Gy， 放療當天和第2天按小鼠體質(zhì)量0.50 mg/(kg·次)瘤內(nèi)注射質(zhì)粒。放療第3天收取腫瘤，切成小塊，一部分制備細胞用于染色，一部分用于提取總RNA和蛋白，立即用液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3腫瘤細胞懸浮液制備用手術刀除去腫瘤周邊組織，切碎新鮮腫瘤組織，加入collagenase-IV/DNaseⅠ處理，置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱30 min, 加入細胞培養(yǎng)液RPMI，2 000 r/min離心10 min，用RPMI洗細胞一次，計數(shù)細胞。

1.2.4STAT3 mRNA表達水平采用熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)方法，采用RNeasy試劑提取細胞總RNA，按iScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，用qPCR檢測STAT3 mRNA表達水平。用ProbeFinder Version 2.45(Roche)軟件設計探針-引物，探針購自Universal Probe Library(UPL)， 人STAT3上游引物序列為5′-CTGCCTAGATCGGCTAGAAAAC-3′，下游引物序列為5′-CCCTTTGTAGGAAACTTTTTGC-3′,內(nèi)參照TATA-box binding protein(TBP)采用Roche’s Reference Assays。qPCR反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、 60 ℃ 30 s(40個循環(huán))。采集待測基因和內(nèi)參照TBP的熒光信號值, 計算ΔΔCt及相對含量(RQ)，RQ=2-ΔΔCt。

1.2.5STAT3 蛋白表達水平采用Western Blot方法，收集細胞，提取總蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，常規(guī)一抗和二抗孵育后， ECL超敏免疫印跡檢測試劑 (Amersham公司) 檢測蛋白表達，用Image J軟件分析圖像強度。

1.2.6 細胞膜蛋白染色收集細胞，染色緩沖液漂洗細胞1次，小鼠CD16/32 抗體和小鼠血清封閉細胞膜FcγⅡ/Ⅲ受體，冰上孵育10 min，2 000 r/min離心10 min，加入染色緩沖液稀釋的熒光標記抗體，冰上避光孵育30 min。用染色緩沖液清漂洗兩次，重懸細胞，用流式細胞儀收集數(shù)據(jù)，GFP陽性的細胞為腫瘤細胞，用Flowjo軟件(treestar)分析數(shù)據(jù)。

1.3　統(tǒng)計學分析

采用Graphpadprism 6.0自帶統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，每組實驗重復3次，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差()表示。多組單變量實驗間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2結果

2.1　惡性B細胞中STAT3 mRNA和蛋白表達水平

與PBS組和RT+empty組比較， RT+shRNA組STAT3 mRNA和蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，分別被抑制了50%~60%和50%，說明放療聯(lián)合STAT3基因特異的shRNA可以有效地抑制惡性B細胞中STAT3的表達。見圖1。

(1)與PBS組比較， P<0.05； (2)與RT+ empty 組比較， P<0.05 圖1　惡性B細胞中STAT3 mRNA和蛋白表達水平 Fig.1　Radiotherapy combined with STAT3 shRNA silenced STAT3 expression

2.2　惡性B細胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表達水平

與PBS組和RT+empty組比較， RT+shRNA組MHCH、CD40及CD80平均熒光強度均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，分別增加了46%、40%和60%，說明放療聯(lián)合STAT3基因特異的shRNA可以有效增加惡性B細胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表達水平。見圖2。

(1)與PBS組比較， P<0.05； (2)與RT+ empty組比較， P<0.05 圖2　惡性B細胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表達水平 Fig.2　Radiotherapy combined with STAT3 shRNA upregulated the expressions of MHCII, CD40 and CD80

3討論

MCL是所有B細胞非霍奇金淋巴瘤中預后較差的腫瘤之一[1-2]。盡管MCL患者對化療加單克隆抗體的一線治療初始反應良好，但幾乎所有的MCL患者最終都會復發(fā)，并對進一步的治療反應越來越差[1-4]。增強惡性B細胞的免疫原性可產(chǎn)生有效的抗淋巴瘤免疫反應[8]。本研究在BALB/c小鼠大腿皮下接種小鼠惡性B細胞淋巴瘤A20細胞形成腫瘤，利用放療大量殺死腫瘤細胞和產(chǎn)生免疫原性細胞，誘導機體發(fā)生免疫反應，同時抑制STAT3表達，觀察惡性B細胞中表面分子MHCII、CD40及CD80的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)放療聯(lián)合抑制STAT3表達有效地上調(diào)了MHCII、CD40和CD80在惡性B細胞的表達，增強了惡性B細胞免疫原性。

放療方法能大量殺死腫瘤細胞，引起免疫原性細胞死亡(Immunogenic Cell Death, ICD)，能誘發(fā)機體發(fā)生適應性免疫反應，消除遠端病灶[9-10]。因此，觸發(fā)ICD可成為B細胞非霍奇金淋巴瘤新的治療方案。但是，放療誘導死亡的細胞也同時釋放線粒體DNA、白細胞介素-6(Interleukelin-6, IL-6) 等因子激活STAT3蛋白表達，促進腫瘤生長，引起腫瘤復發(fā)[11]。因此，本研究為了規(guī)避放療誘導的死亡細胞激活STAT3蛋白表達，選用特異性shRNA抑制STAT3表達并聯(lián)合放療治療惡性B細胞淋巴瘤，結果顯示，放療聯(lián)合抑制STAT3表達能顯著降低STAT3 mRNA和蛋白表達水平，與單純放療比較，放療聯(lián)合抑制STAT3表達治療顯著增加A20細胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表達水平(P<0.05)，說明聯(lián)合治療增強了惡性B細胞的免疫原性的分子表達。筆者所在研究團隊還發(fā)現(xiàn)用抑制STAT3表達聯(lián)合一次大劑量放療能徹底治愈小鼠B細胞非霍奇金淋巴瘤，3月后沒有腫瘤復發(fā)；在這些小鼠上又移植了同樣的小鼠B細胞非霍奇金淋巴瘤，沒有一只小鼠長腫瘤[12]。均說明放療聯(lián)合抑制STAT3表達能消除MCL小鼠殘留的惡性細胞，避免腫瘤復發(fā)，持久增加患者機體持續(xù)的免疫潛能。

綜上，聯(lián)合放療與抑制STAT3基因表達增強了惡性B細胞的MHCII、CD40和CD80的表達，增強了惡性B細胞的免疫原性，促進惡性B細胞成熟。

4參考文獻

[1] Chen Y, Wang M, Romaguera J. Current regimens and novel agents for mantle cell lymphoma [J]. Br J Haematol, 2014(1):3-18.

[2] Dreyling M, Amador V, Callana M, et al. Update on the molecular pathogenesis and targeted approaches of mantle cell lymphoma (MCL)- summary of the 12 annual conference of the EUROPEAN MCL NETWORK [J]. Leuk Lymphoma, 2014(4):1-26.

[3] Foran JM, Cunningham D, Coiffier B, et al. Treatment of mantle-cell lymphoma with rituximab (chimeric monoclonal anti-CD20 antibody): analysis of factors associated with response[J]. Ann Oncol, 2000(Suppl 1):117-121.

[4] Williams ME, Dreyling MH, Kahl BS, et al. Mantle cell lymphoma: report of the 2009 mantle cell lymphoma consortium workshop[J]. Leuk Lymphoma, 2010(3):390-398.

[5] Dietrich S, Boumendil A, Finel H, et al. Outcome and prognostic factors in patients with mantle-cell lymphoma relapsing after autologous stem-cell transplantation: a retrospective study of the European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT)[J]. Ann Oncol, 2014(5):1053-1058.

[6] Sotomayor EM, Borrello I, Rattis FM, et al. Cross-presentation of tumor antigens by bone marrow-derived antigen-presenting cells is the dominant mechanism in the induction of T-cell tolerance during B-cell lymphoma progression[J]. Blood, 2001(4):1070-1077.

[7] Rabinovich GA, Gabrilovich D, Sotomayor EM. Immunosuppressive strategies that are mediated by tumor cells [J]. Annu Rev Immunol, 2007(25):267-296.

[8] Cheng F, Wang H, Horna P，et al. Stat3 inhibition augments the immunogenicity of B-cell lymphoma cells, leading to effective antitumor immunity [J]. Cancer Res, 2012(17)：4440-4448.

[9] Galluzzi L, Kepp O, Kroemer G. Immunogenic cell death in radiation therapy [J]. OncoImmunology, 2013(10): 26536.

[10]Vacchelli E, Vitale I, Tartour E, et al. Trial watch: anticancer radioimmunotherapy [J]. Oncoimmunology, 2013(9):25595.

[11]Gao C, Kozlowska A, Nechaev S, et al. TLR9 signaling in the tumor microenvironment initiates cancer recurrence after radiotherapy [J]. Cancer Res, 2012 (17): 4440-4448.

[12]Zhang Q, Hossain DM, Nechaev S, et al. TLR9mediated siRNA delivery for targeting of normal and malignant human hematopoietic cellsinvivo[J].Blood, 2013(8):1304-1315.

(2015-09-02收稿，2015-09-25修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 周凌