大鼠抑郁模型的建立及其綜合評價(jià)研究

關(guān)宇鵬，王 帥,2,3，孟憲生，2,3*，李天嬌,2,3，包永睿,2,3，孫婉萍

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

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大鼠抑郁模型的建立及其綜合評價(jià)研究

關(guān)宇鵬1，王 帥1,2,3，孟憲生1，2,3*，李天嬌1,2,3，包永睿1,2,3，孫婉萍1

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

目的：建立適宜于抗抑郁藥物評價(jià)的抑郁大鼠動(dòng)物模型及綜合評價(jià)體系，為抗抑郁藥物的藥理藥效評價(jià)奠定前期基礎(chǔ)。方法：選用SD雄性大鼠，在CUMS法基礎(chǔ)上，建立抑郁大鼠動(dòng)物模型，考察造模前和造模7天、14天、21天、35天時(shí)大鼠體重、懸尾次數(shù)、糖水消耗、血清皮質(zhì)酮等指標(biāo)的變化，綜合評價(jià)優(yōu)選造模條件。結(jié)果：與空白組比較，造模21天模型組在體重、糖水消耗、懸尾次數(shù)、游泳時(shí)間、敞箱實(shí)驗(yàn)等方面均有明顯降低趨勢，大鼠血清皮質(zhì)酮含量明顯減少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了抗抑郁藥物評價(jià)的抑郁大鼠動(dòng)物模型建立的合理性。結(jié)論：該模型克服以往存在的工作量大，持續(xù)時(shí)間長、指標(biāo)評價(jià)單一等問題，為抗抑郁藥物的藥效評價(jià)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

大鼠抑郁模型；懸尾次數(shù)；強(qiáng)迫游泳；敞箱實(shí)驗(yàn)；皮質(zhì)酮；綜合評價(jià)

抑郁癥是一種常見的情感性精神障礙疾病，常存在顯著而持久的情緒低落、思維遲鈍、言語動(dòng)作減少、對工作失去興趣等癥狀[1]。其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，引起了廣大科研工作者的關(guān)注。目前常見的抑郁癥研究模型有多種，如Vollmayr等采用微弱電流刺激作為應(yīng)激源引起部分動(dòng)物“無助”，提高了習(xí)得性無助抑郁模型的有效性及可靠性[2]，但如果壓力控制不好，造成過度刺激，也會造成動(dòng)物模型數(shù)據(jù)的不可靠[3]；Porsolt等[4]制造了行為絕望抑郁模型，此模型常用于抗抑郁劑的快速篩選，但假陽性太高，降低了其有效性[5]；Katz等對慢性不可預(yù)見性的應(yīng)激抑郁模型(CUS)進(jìn)行一系列研究[6]，但CUS過程實(shí)際操作難度大，需要特殊儀器設(shè)備，與實(shí)際生活中長期低水平應(yīng)激導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生的機(jī)理有一定差距[7]；Willner等發(fā)展了慢性輕度不可預(yù)見性的應(yīng)激抑郁模型(CUMS)[8]，但存在著工作量較大、持續(xù)時(shí)間較長、指標(biāo)評價(jià)單一等問題[9]。本次實(shí)驗(yàn)是在CUMS法的基礎(chǔ)上進(jìn)行合理優(yōu)化，縮短了造模時(shí)間，并以體重、糖水消耗、懸尾次數(shù)、游泳時(shí)間、敞箱實(shí)驗(yàn)、血清皮質(zhì)酮含量為指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)，最終建立一個(gè)合理的藥理藥效模型。

1 材料

1.1 儀器

島津SPD-10A高效液相色譜儀(日本島津公司)；Milli-Q超純水處理裝置(美國Millipore公司)；HC-2517型高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；XW-80渦旋混合器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；QF-3800氮?dú)獯蹈蓛x(泉州市恒德集團(tuán)有限公司)；HS6150型超聲波清洗器(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 材料與試劑

Open-field自制敞箱(80cm×80cm×50cm)；甲醇(色譜純)(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD雄性大鼠，體重(240±20)g，遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2010-0001，合格證號：211002300002168。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

采用敞箱實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評分，選擇得分相近的大鼠80只，取其中12只作為空白對照組，其余均為模型組。按“2.2”項(xiàng)下造模方法造模，記錄大鼠死亡數(shù)量，于造模后第14天處死12只大鼠，記為模型1組；于造模后第21天處死12只大鼠，記為模型2組；于造模后第35天處死12只大鼠，記為模型3組。

2.2 造模方法

除空白對照組外，動(dòng)物每只單籠飼養(yǎng)，將其禁水24h，禁食24h，夾尾1min，2 200V直流電電擊足底10次(早、中、晚)，水平震蕩5min(160Hz)，明暗顛倒24h，0℃冰水游泳，40℃環(huán)境5min，8種刺激隨機(jī)安排在35天內(nèi)，每日2種，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，空白對照組不予任何刺激。分別在第14天、第21天、第35天末次處理1h后，斷頭處死，取血清，對模型1組、模型2組、模型3組、空白對照組進(jìn)行生化指標(biāo)皮質(zhì)酮檢驗(yàn)。

2.2.1 體重測定 每日9時(shí)每只大鼠加食物10g，模型組在接受禁食刺激時(shí)除外，于造模第1、7、14、21、35天，即每隔1周測量1次體重，記錄體重變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2.2 懸尾次數(shù) 將大鼠成倒掛狀態(tài)，其頭部離臺面約10cm，用板隔開相鄰動(dòng)物的視線，懸掛5min，于造模第1、7、14、21、35天記錄懸尾次數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2.3 糖水消耗 參照文獻(xiàn)[8]，訓(xùn)練動(dòng)物適應(yīng)含糖飲水，每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶，第一個(gè)24h，2個(gè)瓶內(nèi)均裝有1%蔗糖水，24h后，同時(shí)給予每只大鼠500mL兩瓶水，1個(gè)瓶裝1%蔗糖水，1個(gè)瓶裝純水，24h后，取走糖水瓶并稱重，計(jì)算大鼠的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗、糖水偏愛(糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%)，記錄造模第1、7、14、21、35天大鼠糖水偏愛值。為避免體重差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，故1%蔗糖水飲用量按每100g體重消耗的糖水偏愛值表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2.4 強(qiáng)迫游泳 按照Porsolt[4]的行為絕望法，將大鼠置于冰水中游泳，記錄大鼠在冰水中掙扎時(shí)間、漂浮時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2.5 敞箱實(shí)驗(yàn) 敞箱為80cm×80cm×50cm的自制無蓋箱，內(nèi)壁為黑色，底為白色，在底部用黑色筆劃分25個(gè)等格，在造模后第7、14、21、35天進(jìn)行觀察，將一只大鼠放入敞箱正中央，每有三爪以上跨入鄰格記1分；后肢直立1次(兩前爪騰空或攀附墻壁)記1分；沿線行走，以每10cm記1分，記錄5min內(nèi)所得分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2.6 血清皮質(zhì)酮含量檢測 分別于造模第14天、21天、35天末次刺激后1h，摘眼球取血，斷頭處死。采用高效液相色譜法，Agilent TC-C18(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱，以甲醇∶水=60∶40為流動(dòng)相，1.0mL·min-1的流速，30℃的柱溫，242nm的波長下測定大鼠血清皮質(zhì)酮含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

慢性中度不可預(yù)見性應(yīng)激對大鼠行為的影響如表1所示。模型組與空白組比較體重、懸尾次數(shù)、糖水消耗、強(qiáng)迫游泳、敞箱實(shí)驗(yàn)、血清皮質(zhì)酮含量等指標(biāo)均有顯著性差異，且模型2組、模型3組血清皮質(zhì)酮含量較模型1組有明顯下降，而模型3組與2組相比血內(nèi)皮質(zhì)酮的含量變化不大，綜合以上指標(biāo)認(rèn)為此法21天可造模成功。

表1 慢性中度不可預(yù)見應(yīng)激對大鼠行為及生理指標(biāo)的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表2 大鼠血清皮質(zhì)酮含量變化 (±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)在CUMS法的基礎(chǔ)上，整合了獲得性無助、行為絕望、隔離法、慢性應(yīng)激等抑郁模型造模方法，并對其進(jìn)行了改進(jìn)，采用體重、懸尾、糖水消耗、強(qiáng)迫游泳、敞箱實(shí)驗(yàn)、血清皮質(zhì)酮含量等多個(gè)行為及生理指標(biāo)綜合評價(jià)，對最佳造模時(shí)間進(jìn)行考察，建立了一個(gè)改進(jìn)的抑郁癥造模方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠造模7天體重出現(xiàn)下降趨勢，懸尾次數(shù)、敞箱實(shí)驗(yàn)得分、糖水消耗等指標(biāo)均明顯下降，游泳掙扎時(shí)間也出現(xiàn)了一定程度的下降，然而由于對環(huán)境及造模方式的不適應(yīng)，出現(xiàn)了部分大鼠死亡的情況；造模14天時(shí)體重、懸尾次數(shù)、敞箱實(shí)驗(yàn)、游泳掙扎時(shí)間、糖水消耗等指標(biāo)進(jìn)一步下降，且懸尾次數(shù)與空白組比較差異顯著，同時(shí)血清皮質(zhì)酮含量較空白組也有明顯下降，由于抑郁模型成模條件復(fù)雜，極有可能出現(xiàn)假陽性的情況，因此需繼續(xù)造模以待觀察；造模21天時(shí)，體重、糖水消耗、血清皮質(zhì)酮含量與空白組比較差異均非常顯著，其他指標(biāo)較空白組相比也均有明顯下降；造模35天時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)與造模21天相比差別不大，但死亡率明顯增加。故綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將最佳造模時(shí)間確定為21天。此方法彌補(bǔ)了CUMS法工作量大，持續(xù)時(shí)間過長等不足，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果科學(xué)合理，可為今后抗抑郁藥物的新藥研發(fā)、病理研究等提供參考。

[1] 丁國安，余國漢，伍遠(yuǎn)菲，等.加味逍遙湯對抑郁大鼠海馬cAMP,PKA,PKC的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(4):162-164.

[2] 孫欣，劉昌勤.習(xí)得性無助大鼠腳底電刺激后海馬c-FOS表達(dá)[J].中國康復(fù)，2005,20(4)：201-203.

[3] 李曉白，方貽儒，王祖承，等.抑郁癥和焦慮癥動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].上海精神醫(yī)學(xué)，2004,16(4)：241-243.

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

Establishment of A Rat Model of Depression and Comprehensive Evaluation

Guan Yupeng1,Wang Shuai1,2,3,Meng Xiansheng1,2,3*,Li Tianjiao1,2,3,Bao Yongrui1,2,3,Sun Wanping1

(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China； 2. Liaoning province multi-component Chinese Medicine Engineering Technology Research Center，Dalian 116600，China； 3. Liaoning Province Modern Traditional Chinese Medicine Research and Engineering Laboratory，Dalian 116600，China)

Objective:To establish a depression animal model of rats that is suitable for antidepressant drug evaluation and a comprehensive evaluation system, the model laid the foundation for evaluation of the pharmacological efficacy of antidepressant drugs. Methods:On the basis of CUMS method, to establish a depression animal model in SD male rats, and Before the investigation modeling, modeling 7 days, 14 days, 21 days, 35 days rat body weight, hanging tail number, sugar consumption, and other indicators of changes in serum corticosterone, comprehensive evaluation of the preferred modeling conditions. Results:Compared with the control group, model group in body weight, sugar consumption, hanging tail number, swimming time, Open Field, etc. are significant changes, and significantly reduced in corticosterone levels in the blood of rats . The experimental results prove that the depression animal model used of to evaluate antidepressant drug is rationally.Conclusion:This model overcomes the heavy workload, long duration, a single index evaluation and other issues in the past, the study evaluated the efficacy of antidepressants experimental basis.

Rat Model of Depression; Hanging Tail Number; Forced Swimming;Open Field Experiments; Corticosterone; Comprehensive Evaluation

2014-11-19

國家自然科學(xué)基金(81241111)；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(LR2013044)

關(guān)宇鵬(1989-)，男，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量分析及作用機(jī)制。

孟憲生(1964-)，男，博士，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教授，研究方向?yàn)橹兴幗M分配伍、代謝組學(xué)及藥品質(zhì)量分析。E-mail：mxsvvv@126.com

R284

A

1673-2197(2015)09-0003-03

10.11954/ytctyy.201509002