24孔板法誘變選育高產(chǎn)紅曲黃色素菌株

楊 強，岳建明，王成濤，*，文雁君

（1.北京工商大學，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京100048；2.北京工商大學，食品質量與安全北京實驗室，北京100048；3.河南中大生物工程有限公司，河南鄭州451162）

生物工程

24孔板法誘變選育高產(chǎn)紅曲黃色素菌株

楊 強1，2，岳建明1，王成濤1，2，*，文雁君3

（1.北京工商大學，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京100048；2.北京工商大學，食品質量與安全北京實驗室，北京100048；3.河南中大生物工程有限公司，河南鄭州451162）

以紅曲霉F9-2為出發(fā)菌株，24孔板培養(yǎng)法結合紫外線-氯化鋰復合誘變處理選育高產(chǎn)紅曲黃色素菌株。實驗結果表明：在紫外照射130 s、氯化鋰添加濃度為0.1%的復合誘變條件下得到的菌株Y16，經(jīng)液態(tài)發(fā)酵后產(chǎn)黃色素高達488 U/mL，與出發(fā)菌相比，黃色素色價提高了37.1%。經(jīng)10次傳代培養(yǎng)，色價穩(wěn)定，可作為生產(chǎn)紅曲黃色素的優(yōu)良菌株。

紅曲霉，24孔板，復合誘變，紅曲黃色素

紅曲作為我國傳統(tǒng)的藥食兩用產(chǎn)品，尤其是紅曲色素作為天然食品著色劑其應用歷史已達數(shù)千年之久。如今，食品安全問題日益受到人們的關注，對于紅曲色素的研究也更加具有意義和實際價值[1]。紅曲色素主要包括三類復合色素：紅曲紅色素、紅曲黃色素和紅曲橙色素[2-4]。目前的紅曲色素產(chǎn)品中以紅色素居多，黃色素在紅曲混合色素中的含量較低。黃色素作為一類主要的食用色素品種，其色澤鮮亮，容易引起人的食欲與購買欲，通常占市場需求量的50%以上，因此研究及開發(fā)紅曲黃色素具有很高的實際應用價值與商業(yè)推廣價值[5]。

通過理化誘變選育高產(chǎn)紅曲黃色素菌株，是我國紅曲色素生產(chǎn)企業(yè)提升色素產(chǎn)量的重要途徑之一。理化誘變選育菌種操作簡便，且選育出的紅曲霉遺傳性狀穩(wěn)定[6]。目前理化誘變選育高產(chǎn)紅曲色素的方法很多，國內外選育高產(chǎn)紅曲色素菌株主要利用紫外、超聲、微波、60Co-γ、氯化鋰、雙氧水、亞硝基胍、硫酸二乙酯等方法，而我國采用上述誘變方法得到的紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲黃色素色價均處于偏低水平[7-11]。泰國的Yongsmith等[12]一直致力于選育高產(chǎn)紅曲黃色素菌株，液態(tài)發(fā)酵色價不高，但固態(tài)發(fā)酵紅曲米中黃色素色價可達2224 U/g。雖然誘變育種存在許多優(yōu)勢，但是其隨機性、盲目性問題突出，且存在耗時、勞動強度大等缺點[13]。由于紅曲霉產(chǎn)黃色素色價普遍偏低，很難實現(xiàn)工業(yè)化，為提高紅曲黃色素的液態(tài)發(fā)酵色價，選育優(yōu)良菌株尤為重要。本文采用24孔板高通量法輔助誘變篩選紅曲黃色素高產(chǎn)菌株，與傳統(tǒng)搖瓶篩選方法比較，24孔板法減少了儀器的使用、降低了工作量且提升了篩選速度，對今后其他菌株的誘變選育具有重要參考意義。以實驗室篩得的紫紅紅曲霉菌株F9-2作為出發(fā)菌，利用紫外-氯化鋰復合誘變選育高產(chǎn)紅曲黃色素菌株，以期為紅曲黃色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫紅紅曲霉（Monacus purpureus） 編號F9-2，本實驗室篩得并保存；無水氯化鋰、乳酸、無水乙醇、麥芽浸粉、瓊脂、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氫鉀、硝酸鈉、硫酸鎂、豆粕粉、玉米漿 國藥集團化學試劑有限公司，分析純；大米粉 中糧米業(yè)有限公司，食用級；基礎培養(yǎng)基 麥芽浸粉2%，瓊脂2%，葡萄糖0.5%，蛋白胨0.1%，pH自然（誘變培養(yǎng)基為在此配方基礎上添加LiCl），121℃下滅菌20 min；擴大培養(yǎng)基 葡萄糖2%，蛋白胨0.3%，酵母提取物0.4%，麥芽浸粉2%，瓊脂2%，KH2PO40.2%，NaNO30.2%，MgSO40.1%，pH自然，121℃下滅菌20 min；種子培養(yǎng)基 大米粉4%，蛋白胨0.8%，豆粕粉0.5%，KH2PO40.2%，NaNO30.2%，MgSO40.1%，乳酸調節(jié)pH4.0，裝液量50 mL/250 mL，121℃下滅菌20 min；發(fā)酵培養(yǎng)基 大米粉7.7%，葡萄糖7.5%，豆粕粉0.2%，KH2PO40.05%，NaNO30.18%，MgSO40.1%，玉米漿0.35%，乳酸調節(jié)pH4.0，裝液量50 mL/250 mL，121℃下滅菌20 min。

DL-CJ-1NDII型單人單面潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BSA224S型電子天平 塞多利斯科學儀器（北京）有限公司；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設備廠；TGL-10C型高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；PHS-3D型pH計 上海三信儀表廠；UV-2450型紫外可見分光光度計 日本島津公司；DHG-9145型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；HJ-1型磁力加熱攪拌器 國華儀器廠；24方形深孔板 北京半夏科技發(fā)展有限公司；Synergy H1型全功能酶標儀 美國伯騰公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 出發(fā)菌株的活化 將紅曲霉菌株F9-2接種于擴大培養(yǎng)基試管斜面，30℃培養(yǎng)7 d進行活化。

1.2.2 孢子懸液的制備 菌株斜面30℃培養(yǎng)7 d后，用10 mL 0.85%的無菌生理鹽水沖洗斜面孢子，孢子液倒入含玻璃珠的三角瓶中200 r/min振蕩1 h，待孢子充分散開，用無菌擦鏡紙濾除菌絲，制成孢子懸液，最后將孢子濃度稀釋為1×106個/mL左右。

1.2.3 紅曲色價的測定 取3 mL發(fā)酵液加入27 mL 70%乙醇溶液中，恒溫水浴鍋60℃浸提2 h，4000 r/min離心10 min后取上清液稀釋2000倍后，用分光光度計測定410 nm處吸光值[14]。

紅曲色素的色價（U/mL）=吸光值×稀釋倍數(shù)

1.2.4 紫外線誘變 將帶有轉子的玻璃平皿置于磁力攪拌器上，調整玻璃平皿距離紫外燈20 cm左右，倒入10 mL濃度為1×106個/mL左右的孢子懸液。于黑暗環(huán)境下照射10、30、50、70、90、110、130、150 s后，分別吸取0.1 mL孢子懸液涂布于平板培養(yǎng)基中，每一個梯度處理3個重復，30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)5 d，以未經(jīng)紫外線照射的原始孢子液為空白對照，讀取菌落個數(shù)，計算致死率，確定最優(yōu)紫外照射時間。

致死率（%）=（空白平板上的菌落數(shù)-誘變培養(yǎng)基上的菌落數(shù)）/空白平板上的菌落數(shù)×100

1.2.5 氯化鋰誘變 分別配制氯化鋰濃度為0.05%、0.075%、0.1%、0.125%、0.15%、0.175%、0.2%的基礎培養(yǎng)基，孢子懸液經(jīng)紫外照射130 s后接種于不同濃度氯化鋰的培養(yǎng)基中，每一個梯度處理做3個重復，30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)5 d，以紫外照射孢子為空白對照，讀取菌落個數(shù)，計算致死率，確定最優(yōu)氯化鋰誘變濃度。

致死率（%）=（空白平板上的菌落數(shù)-誘變培養(yǎng)基上的菌落數(shù)）/空白平板上的菌落數(shù)×100

1.2.6 紫外-氯化鋰復合誘變 首先按1.2.4實驗中得到的紫外線誘變最佳照射時間誘變照射孢子懸液，然后在1.2.5實驗結果確定的最佳氯化鋰濃度培養(yǎng)基平板上涂布培養(yǎng)。

1.2.7 初篩 經(jīng)過紫外-氯化鋰復合誘變后的菌種于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d，選取菌落直徑大且顏色較深的單菌落，挑取菌絲后接入裝有1 mL/孔種子培養(yǎng)基的24孔板中（每孔放一個滅菌的玻璃珠），33℃、220 r/min培養(yǎng)42 h。將培養(yǎng)好的種子按9%接種量接入裝有1 mL/孔發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板中（每孔放一個滅菌的玻璃珠），33℃、220 r/min培養(yǎng)60 h。

培養(yǎng)完成后，用移液槍從24孔板中吸取0.1 mL發(fā)酵液，加入裝有0.9 mL 70%乙醇溶液的離心管中，混勻，靜置15～20 min后，于3000 r/min離心5 min；取上清液，加到96孔板中，每孔200 μL。用酶標儀測定全波長下的吸光度，計算色價值后，選取色價高的菌株進行液體搖瓶復篩。

1.2.8 復篩 從擴培后的初篩菌種平板培養(yǎng)基中挑取2～3環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基中（裝液量50 mL/250 mL），于33℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2 d。再按照6%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量50 mL/250 mL），于33℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d。發(fā)酵完成后按照1.2.3的方法測定410 nm吸光值，換算成色價值。與出發(fā)菌株的產(chǎn)黃色價值進行比較，選取色價高于出發(fā)菌株的誘變菌斜面低溫保存。

1.2.9 誘變株的穩(wěn)定性實驗 將經(jīng)1.2.8復篩所得的紅曲霉菌株在平板基礎培養(yǎng)基上傳代10次，分別測定每代發(fā)酵產(chǎn)紅曲黃色素色價值，觀察其產(chǎn)色素能力是否穩(wěn)定。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 采用軟件SPSS 17.0對復篩數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 紫外線誘變劑量的確定

出發(fā)菌紅曲霉F9-2的孢子懸液經(jīng)紫外燈照射不同時間的致死率曲線如圖1所示。通常紫外燈照射誘變的致死率在20%～90%之間的正突變幾率較高，且突變后菌種遺傳物質穩(wěn)定[15]。由圖1可知隨著紫外照射時間的延長，致死率逐漸增加。當紫外照射時間為130 s時，致死率達到80.4%。照射150 s，致死率已達到95.4%。因此本實驗選用致死率為80%左右的130 s為紫外最佳誘變劑量。

圖1 紫外致死曲線Fig.1 The lethality curve of UV

2.2 氯化鋰誘變劑量的確定

出發(fā)菌紅曲霉F9-2的孢子懸液經(jīng)最佳紫外照射劑量處理后，于不同濃度氯化鋰培養(yǎng)基中涂布后黑暗倒置培養(yǎng)，得到氯化鋰濃度誘變致死率曲線如圖2所示。隨著氯化鋰濃度的增加，致死率逐漸增加。當氯化鋰濃度為0.1%時，致死率為80.6%；當氯化鋰濃度為0.125%～0.175%時，致死率為87.8%～97.6%；當氯化鋰濃度為0.2%時，致死率已達到100%。因此本實驗采用致死率為80%左右的氯化鋰濃度0.1%為最佳誘變劑量。

圖2 氯化鋰致死曲線Fig.2 Lethality curve of LiCl

2.3 紫外、氯化鋰復合誘變處理

孢子懸液經(jīng)紫外線照射130 s后涂布于含0.1%氯化鋰的平板培養(yǎng)基上復合誘變培養(yǎng)，共誘變處理20批次，得到突變子419株。選取直徑大且顏色較深的菌株，按照1.2.8的方法培養(yǎng)后測定誘變株的色價。其中148孔無生長，199孔吸光值過低，其余72株與出發(fā)菌株F9-2的產(chǎn)黃色素能力進行比較，結果如圖3所示。

由圖3可知，72個突變株中有12株的黃色素色價高于出發(fā)菌株F9-2（橫向直線所示），其中Y16的孔板發(fā)酵液色價值最高，達到了44.8 U/mL，比出發(fā)菌高出了27.1%。這12株產(chǎn)黃色素高的菌株進行液體搖瓶復篩，按照1.2.3的紅曲色素色價測定方法計算，最終所得結果如圖4所示。

圖3 復合誘變突變菌產(chǎn)色素情況Fig.3 Monascus pigment production of compound mutagenesis mutant

圖4 復合誘變結果Fig.4 Results of combined mutagenesis

由圖4可知，紫外誘變和氯化鋰誘變復合使用，其誘變效果非常明顯。與圖4中出發(fā)菌株紅曲霉F9-2的產(chǎn)黃色價相比，復合誘變得到的12株突變菌株有8株菌的產(chǎn)黃色能力高于原始菌株。其中突變株Y1、Y16、Y31的產(chǎn)紅曲黃色素能力經(jīng)t檢驗顯著性分析結果均為極顯著（p＜0.01），Y1、Y31較出發(fā)菌的產(chǎn)黃色素能力分別提高了30.6%和29.5%。Y16的產(chǎn)黃色素能力提高最多，與出發(fā)菌紅曲霉F9-2相比，其所產(chǎn)黃色素色價提高了37.1%。周波等[16]利用物理化學法誘變選育的高產(chǎn)紅曲黃色素菌株雖然黃色素色調高達3.5左右，但紅曲黃色素的最高色價僅為140 U/mL左右。

表1 突變株遺傳穩(wěn)定性實驗Table 1 Genetic stability of mutants

2.4 突變株的遺傳穩(wěn)定性

對本實驗獲得的產(chǎn)黃色素較高的3株突變株Y1、Y16、Y31進行傳代穩(wěn)定性考察。將突變菌株分別在基礎培養(yǎng)基平板上連續(xù)傳10代后，搖瓶發(fā)酵考察產(chǎn)紅曲黃色素的穩(wěn)定性，結果見表1。

由表1結果可知，突變菌株Y31產(chǎn)黃色素的能力在傳代過程中出現(xiàn)比較明顯的衰退，菌株Y1和Y16在傳代過程中，產(chǎn)黃色素能力則基本穩(wěn)定，這表明復合誘變得到的突變菌株Y1和Y16菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。比較Y1和Y16可知，Y16的產(chǎn)紅曲黃色素能力最強且最為穩(wěn)定，經(jīng)過10代的傳代培養(yǎng)，其產(chǎn)黃色素色價值基本穩(wěn)定在486 U/mL左右。相較于傳代3次～6次的穩(wěn)定性實驗，本實驗所得突變菌經(jīng)過10次傳代培養(yǎng)，其產(chǎn)紅曲黃色素色價穩(wěn)定性得到很好的驗證。

3 結論

本文采用24孔板法輔助紫外-氯化鋰復合誘變篩選高產(chǎn)紅曲黃色素菌株。確定了最佳紫外照射時間為130 s，最佳氯化鋰添加濃度為0.1%。紫外-氯化鋰復合誘變得到的誘變效果非常明顯，證明復合誘變對于紅曲霉產(chǎn)黃色素的提高有顯著的作用。復合誘變篩選出一株高產(chǎn)紅曲黃色素菌株Y16，產(chǎn)紅曲黃色素色價高達488 U/mL，較原始菌株提高了37.1%。經(jīng)10次傳代培養(yǎng)，證明其傳代穩(wěn)定性良好，屬于高產(chǎn)菌。本實驗得到高產(chǎn)紅曲黃色素為理化誘變突變菌，還需對該菌進行培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的進一步優(yōu)化研究，以便為今后的工業(yè)化生產(chǎn)所用。

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Breeding of Monascus with high-yield yellow pigment by 24 well-plate assay combining with mutation

YANG Qiang1，2，YUE Jian-ming1，WANG Cheng-tao1，2，*，WEN Yan-jun3
（1.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；3.Henan Zhongda Biological Engineering Co.，Ltd.，Zhengzhou 451162，China）

Monascus F9-2 was used as the original strain；then the high-yield yellow pigment of Monascus Y16 strain was obtained by UV（130 s）and LiCl（0.1%）complex mutation combining with the 24 well-plate assay. The results showed that the yellow pigment value of Monascus Y16 could reach 488 U/mL and the value was 37.1%higher than the starting strain.The stable genotype was verified through ten times of transferring of culture and was hence a fine strain for producing high-yield yellow pigment.

Monascus；24 well-plate；complex mutation；Monascus yellow pigment

TS201.3

A

1002-0306（2015）22-0156-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.024

2015－03－19

楊強（1990-），女，碩士，助理實驗師，研究方向：食品微生物與發(fā)酵技術，E-mail：yq_0314@126.com。

*通訊作者：王成濤（1969-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：wct5566@163.com。

國家自然科學基金青年基金項目（31401669，31301411）；北京市科技計劃項目（Z151100001215008）；北京市科技計劃項目和北京市屬高等學校食品科學創(chuàng)新團隊項目（IDHT20130506）。