椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用

呂 爽，田呈瑞

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062；2.西安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西西安710065）

椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用

呂 爽1，2，田呈瑞1，*

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062；2.西安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西西安710065）

本文研究了椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明：椒樣薄荷多酚高劑量灌胃處理（400 mg/kg BW·d）顯著抑制了小鼠血清中堿性磷酸酶（AKP）、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活力的升高（p＜0.05）；肝臟病理組織切片觀察結(jié)果顯示，椒樣薄荷多酚高劑量灌胃處理小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，只有點(diǎn)狀壞死，無大面積壞死，進(jìn)一步表明椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致小鼠肝損傷具有保護(hù)作用；另外，椒樣薄荷多酚高劑量灌胃處理顯著抑制了小鼠血清中總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量的升高（p＜0.05）；顯著增強(qiáng)了肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）兩種抗氧化酶活力，顯著增強(qiáng)了總抗氧化能力（T-AOC），顯著降低了肝臟中丙二醛（MDA）含量（p＜0.05）。說明椒樣薄荷多酚在預(yù)防和改善肝損傷方面具有一定的應(yīng)用開發(fā)潛力。

椒樣薄荷，多酚，小鼠，肝損傷，保護(hù)作用

CCl4肝損傷動(dòng)物模型是目前公認(rèn)的用來評(píng)價(jià)肝細(xì)胞損傷保護(hù)藥物的經(jīng)典動(dòng)物模型，其表現(xiàn)出來的癥狀、肝功能檢測指標(biāo)、肝臟病理改變與病毒性肝炎具有相似性[1]。CCl4在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過P450 2E1代謝產(chǎn)生三氯甲基自由基（·CCl3）、二氯甲基自由基（·CCl2）及過氧化甲基自由基（CCl3OO·）[2]，其引起了細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜不飽和脂肪酸的過氧化，從而改變了細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性，破壞了細(xì)胞膜的完整性和正常結(jié)構(gòu)，損傷了肝細(xì)胞[3]。肝損傷除了影響到患者的日常生活，還會(huì)引發(fā)其他并發(fā)癥，如繼發(fā)性出血和急性肝腎功能衰竭等。目前一般采用保肝降酶藥物治療方法，氧化應(yīng)激是肝損傷的重要原因之一，一些抗氧化劑也可以預(yù)防肝損傷。目前國內(nèi)外對(duì)于椒樣薄荷的研究主要集中在其精油組分和功效性方面，而對(duì)于椒樣薄荷多酚的研究較少。本文利用CCl4所致小鼠肝損傷模型，評(píng)價(jià)了椒樣薄荷多酚對(duì)小鼠肝損傷的保護(hù)作用，以期為椒樣薄荷多酚多元化開發(fā)利用提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

椒樣薄荷多酚 在西安市農(nóng)科所三橋農(nóng)業(yè)科技示范園采摘椒樣薄荷生殖生長期葉片，用甲醇超聲波提取后，濾液真空30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL左右，將其真空冷凍干燥，用純凈水配制成低、中、高三個(gè)劑量組，椒樣薄荷多酚含量的測定采用福林酚比色法[4]，以沒食子酸為參照標(biāo)準(zhǔn)品，多酚含量為11.6% ±1.1%（n=6）；生理鹽水、四氯化碳 購自廣東光華化學(xué)廠有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸 購自北京協(xié)和制藥廠；甘油三脂（TG）測定試劑盒、總膽固醇（TC）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測定試劑盒和堿性磷酸酶（AKP）測定試劑盒 購自南京建成生物工程研究所；昆明種雄性小鼠 清潔級(jí)，許可證號(hào)SCXK（京）2011-0012，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。

LGJ-18C冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；FSH-2可調(diào)高速勻漿機(jī) 金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；LS-100石蠟包埋機(jī) 沈陽市龍首電子儀器有限公司；HY325B石蠟切片機(jī) 北京東方德教育科技有限公司；ME21（MSHOT）光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯（Olympus）公司；Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀 美國熱電（上海）科技儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)30 d，隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組和椒樣薄荷多酚低、中、高劑量組，每組10只。椒樣薄荷多酚低、中、高劑量組灌藥劑量分別為100、200、400 mg/kg BW·d，陽性對(duì)照組灌胃聯(lián)苯雙酯（將聯(lián)苯雙酯滴丸以羧甲基纖維素鈉溶液溶解）劑量為200 mg/kg BW·d，每天灌胃一次，每次0.5 mL，連續(xù)30 d。正常對(duì)照組及模型對(duì)照組的小鼠給予等量生理鹽水。各組小鼠自由攝食、飲水。每周稱體重一次，以調(diào)整灌胃體積。末次給藥2 h后模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組和椒樣薄荷多酚低、中、高劑量組腹腔注射0.3 mL 1%（v/v）CCl4植物油溶液，正常對(duì)照組腹腔注射0.3 mL植物油，禁食，自由飲水。禁食12 h后，將小鼠稱重后眼眶取血，在常溫下1500 r/min離心15 min，37℃放置0.5 h后于2000 r/min離心10 min，分離血清備用。

1.2.2 體重及免疫器官的測定 小鼠處死后，立即摘取肝臟和脾臟，去除系膜及脂肪，用生理鹽水漂洗，并用濾紙吸干水分后稱重，按照下式計(jì)算肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)[5]。

1.2.3 血清指標(biāo)的測定 血清堿性磷酸酶（AKP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性及總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）含量測定方法參考各試劑盒說明書。

1.2.4 肝臟指標(biāo)的測定 將小鼠肝臟加10倍生理鹽水充分研磨，制成10%（m/v）的肝勻漿，以3000 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書，采用分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活力、超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、總抗氧化能力（T-AOC）。

1.2.5 肝臟組織病理學(xué)觀察 將各組小鼠的新鮮肝臟切成小塊，用10%福爾馬林固定，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，然后經(jīng)過切片和脫蠟處理，利用常規(guī)HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD），采用Excel 2007和SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響見表1。

表1 各組小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)（X±SD，n=10）Table 1 Liver and spleen index of mice in each group（X±SD，n=10）

從表1可知，與正常組相比，模型組肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高（p＜0.05），表明CCl4造模能夠引起小鼠的肝臟、脾臟腫大。與模型組相比，陽性組（聯(lián)苯雙酯藥物）和椒樣薄荷多酚中劑量、高劑量組能夠降低小鼠肝臟指數(shù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異（p＜0.05），且高劑量組與陽性組（聯(lián)苯雙酯藥物）效果無顯著性差異，說明椒樣薄荷多酚中、高劑量組能夠抑制CCl4所致小鼠肝臟腫大現(xiàn)象。與模型組相比，陽性組（聯(lián)苯雙酯藥物）能夠降低脾臟指數(shù)（p＜0.05），椒樣薄荷多酚低劑量、中劑量和高劑量組脾臟指數(shù)雖有所減少，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示與模型組無顯著性差異。

2.2 椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠血清AKP、ALT和AST活力的影響

椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠血清AKP、ALT和AST活力的影響結(jié)果見表2。

血清中AKP活力的升高可作為衡量肝臟受損程度的指標(biāo)之一。從表2可知，與正常組相比，模型組AKP活力顯著升高（p＜0.05）。陽性組和椒樣薄荷多酚中劑量組和高劑量組血清中AKP活力顯著低于模型組AKP活力（p＜0.05），其中，中、高劑量組效果無顯著性差異。

表2 椒樣薄荷多酚對(duì)小鼠血清AKP、ALT和AST活力的影響（X±SD，n=10）Table 2 Effect of peppermint polyphenols on AKP，ALT，and AST activities in serum of mice（X±SD，n=10）

如果1%的肝細(xì)胞壞死，可以使血清中ALT濃度增加1倍[6]。從表2可知，與正常組相比，模型組ALT活力顯著增加（p＜0.05）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，陽性組和椒樣薄荷多酚低劑量、中劑量、高劑量組ALT活力均顯著低于模型組（p＜0.05），其中，中、高劑量組效果無顯著性差異。

血清中AST活力上升是炎癥的指標(biāo)，也是組織壞死的重要指標(biāo)[7]。只有肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死和破壞時(shí)，才會(huì)引起血清中AST活力升高。從表2可知，與正常組相比，模型組AST活力有顯著升高（p＜0.05），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，陽性組和椒樣薄荷多酚低劑量、中劑量、高劑量組中AST活力顯著（p＜0.05）低于模型組，且中、高劑量組效果無顯著性差異。

2.3 椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠血清中TC和TG含量的影響

椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠血清中TC和TG含量的影響結(jié)果見表3。

表3 椒樣薄荷多酚對(duì)小鼠血清中TC、TG含量的影響（X±SD，n=10）Table 3 Effect of peppermint polyphenols on the content of TC and TG in serum of mice（X±SD，n=10）

從表3可以看出，與正常組相比，模型組血清中TC和TG含量均顯著升高（p＜0.05），說明CCl4引起肝損傷后會(huì)導(dǎo)致小鼠血清中TC和TG含量的積累，而給予椒樣薄荷多酚不同劑量組給藥后，TC和TG含量均有不同程度的降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，椒樣薄荷多酚高劑量組TC含量顯著低于模型組（p＜0.05），且與正常組和陽性組無顯著性差異，TG含量也顯著低于模型組（p＜0.05），且與陽性組無顯著性差異。

2.4 椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠抗氧化能力的影響

椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠抗氧化能力的影響見表4。

表4 椒樣薄荷多酚對(duì)小鼠肝臟抗氧化能力的影響（X±SD，n=10）Table 4 Effect of peppermint polyphenols on antioxidant activities in liver of mice（X±SD，n=10）

SOD是體內(nèi)將活性氧自由基代謝的主要功能性酶，它能將細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生的活性氧自由基代謝成過氧化氫，生成的過氧化氫在CAT和谷胱甘肽過氧化酶的催化下能分解成水，從而清除自由基，抑制細(xì)胞和組織的氧化損傷[8]。從表4可看出，與正常組相比，模型組中SOD酶活及CAT酶活均顯著降低（p＜0.05），陽性組和椒樣薄荷多酚高劑量組中SOD酶活顯著高于模型組（p＜0.05），陽性組和椒樣薄荷多酚中、高劑量組CAT酶活顯著高于模型組（p＜0.05）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，高劑量組中SOD酶活與正常組和陽性組均無顯著性差異，CAT酶活與陽性組無顯著性差異。

MDA含量的高低可以反映細(xì)胞受自由基攻擊的程度[9]。從表4可看出，與正常組相比，模型組中MDA含量顯著提高（p＜0.05），與模型組相比，陽性組和椒樣薄荷多酚中、高劑量組肝臟中MDA含量顯著降低（p＜0.05），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，高劑量組與陽性組效果無顯著性差異。

T-AOC能力指機(jī)體整個(gè)氧化防御體系的狀態(tài)，該體系主要通過三種途徑發(fā)揮氧化防御的作用：一是消除自由基和活性氧以免引發(fā)脂質(zhì)過氧化；二是分解過氧化氫物，阻斷過氧化鏈；三是螯合對(duì)氧化起催化作用的金屬離子[10]。從表4可看出，與正常組相比，模型組T-AOC能力顯著降低（p＜0.05），與模型組相比，陽性組和椒樣薄荷多酚中、高劑量組T-AOC能力顯著提高（p＜0.05），且高劑量組與陽性組效果無顯著性差異。

2.5 椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響

不同實(shí)驗(yàn)組中小鼠肝臟病理組織學(xué)觀察結(jié)果見圖1。

病理組織學(xué)切片結(jié)果顯示，正常組的小鼠肝細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整且胞漿豐富，細(xì)胞核大而圓，核質(zhì)分布均勻（見圖1A）。模型組肝細(xì)胞具有明顯損傷，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞發(fā)生腫脹或破裂，細(xì)胞核大小不等，呈現(xiàn)不同程度固縮，細(xì)胞質(zhì)疏松，肝細(xì)胞有點(diǎn)狀及碎片狀壞死，壞死處，肝細(xì)胞有彌漫性水腫，部分肝細(xì)胞發(fā)生水樣變性，且細(xì)胞胞漿空泡明顯（圖1B）。陽性對(duì)照組未見肝細(xì)胞腫脹或破裂，有部分肝細(xì)胞胞漿疏松，有點(diǎn)狀壞死，部分細(xì)胞核發(fā)生一定程度固縮（圖1C）。椒樣薄荷多酚低、中劑量組肝細(xì)胞表現(xiàn)出點(diǎn)狀或片狀壞死，部分細(xì)胞破裂，細(xì)胞核發(fā)生不同程度固縮（圖1D～E）。椒樣薄荷多酚高劑量組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，部分肝細(xì)胞胞漿疏松，有點(diǎn)狀壞死，而無大片壞死，有少部分細(xì)胞核發(fā)生一定程度固縮（圖1F）。

圖1 小鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)觀察（HE×400）Fig.1 Hepatic pathological observations of mice（HE×400）

3 結(jié)論

3.1 椒樣薄荷多酚中、高劑量組對(duì)CCl4所致小鼠肝臟腫大現(xiàn)象保護(hù)作用顯著，對(duì)脾臟腫大現(xiàn)象無顯著保護(hù)作用。

3.2 高劑量椒樣薄荷多酚能夠抑制CCl4所致肝損傷小鼠血清中AKP、ALT和AST酶活力升高，但抑制效果不如聯(lián)苯雙酯藥物。小鼠肝臟病理組織切片觀察結(jié)果表明，椒樣薄荷多酚高劑量組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，只有點(diǎn)狀壞死，無大面積壞死，進(jìn)一步說明高劑量椒樣薄荷多酚對(duì)CCl4所致小鼠肝損傷具有一定保護(hù)作用。

3.3 高劑量椒樣薄荷多酚顯著抑制CCl4所致肝損傷小鼠血清中TC和TG含量的升高，其效果與聯(lián)苯雙酯藥物相當(dāng)。

3.4 高劑量椒樣薄荷多酚顯著抑制CCl4所致小鼠肝臟中SOD和CAT兩種抗氧化酶活力降低，且對(duì)于MDA含量的升高和T-AOC能力的降低也有顯著的抑制作用，效果均與聯(lián)苯雙酯藥物相當(dāng)。

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Protective effect of peppermint polyphenols on CCl4-induced liver damage in mice

LV Shuang1，2，TIAN Cheng-rui1，*
（1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shannxi Normal University，Xi’an 710062，China；2.Xi’an Agriculture Technology and Popularization Center，Xi’an 710065，China）

The protective effect of peppermint polyphenols on CCl4-induced liver damage in mice was studied in this paper.The results showed that the high dosage treatment（400 mg/kg BW·d）by gavage of peppermint polyphenols significantly inhibited the increase of AKP，ALT，AST activity（p＜0.05）.The pathological tissue biopsies showed that liver cells of mice in high dose group remained intact with a little spotty necrosis，and had no large necrosis area，it further indicated the peppermint polyphenols had protective effect on liver damaged by CCl4.On the other，the high dosage treatment by gavage of peppermint polyphenols significantly inhibited the elevation of content of TC and TG in serum，and increased the SOD，CAT and T-AOC level in liver，and deceased the content of MDA in liver（p＜0.05）.It showed that peppermint polyphenols had potential to be developed in the aspect of preventing and improving liver damage.

peppermint；polyphenols；mice；liver damage；protective effect

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0358-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.065

2015－03－20

呂爽（1979-），女，博士研究生，主要從事植物資源開發(fā)利用方面的研究，E-mail：gracelv79@163.com。

*通訊作者：田呈瑞（1956-），男，教授，主要從事植物資源開發(fā)利用方面的研究，E-mail：12502242＠qq.com。

國家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2007EA851010）。