新型苯甘氨酸衍生物“刷型”手性固定相的制備及其應(yīng)用*

賓 琴，付克勤，張俊俊，陳 偉，柏正武

(武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢 430073)

手性藥物中各對映體間的藥理活性通常具有較大差異［1］，往往只有一種對映體有藥理活性，而另一種對映體無藥理活性，甚至有毒副作用［2－4］。隨著人們對手性藥物需求的不斷增長，研究手性化合物對映體的拆分與檢測具有重要意義。

手性固定相的高效液相色譜法是檢測手性化合物對映體最成熟的方法［5］?！八⑿汀惫潭ㄏ嗟倪x擇體為手性小分子，這類固定相具有柱容量高、對映體選擇性好等優(yōu)點，常用于氨基酸及氨基酸衍生物或內(nèi)酰胺等手性化合物的對映體檢測中。苯甘氨酸衍生物常用作“刷型”固定相的選擇體［6－11］。Pirkle 等［9］研究了一類苯甘氨酸衍生物手性固定相，雖然其手性識別能力不及Whelk－O1，但可以識別的化合物種類多，如非甾體抗炎藥、苯二氮雜酮等，應(yīng)用也較為廣泛;袁黎明等［10－11］報道了兩種 D－苯甘氨酸衍生物手性固定相，這類固定相的分離選擇性傾向于醇類、胺類、氨基酸的對映異構(gòu)體以及一些手性藥物。因此，研究這類固定相的制備方法，特別是手性選擇體的固定化方法，發(fā)掘新的“刷型”手性固定相具有重要的實用價值。

本文以氨基酸(1a～1c)為原料，先制得氨基酸甲酯鹽酸鹽(2a～2c);2再與3，5－二硝基苯甲酰氯(3)反應(yīng)合成了3個N－?；璂－苯甘氨酸甲酯(4a ～4c，Scheme 1)。D－2－氯苯甘氨酸(1b)和3，5－二甲基苯甲酰氯(5)或 D－4－氯苯甘氨酸(1d)和3分別經(jīng)縮合反應(yīng)合成了N－3，5－二甲基苯甲酰基－D－2－氯苯甘氨酸(6)或 N－3，5－二硝基苯甲?；璂－4－氯苯甘氨酸(7，Scheme 2);其中 4b，4c，6和7為新化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，IR和元素分析表征。分別以胺－酯交換法和縮合反應(yīng)將4a，4c，6和7固定在氨丙基硅膠(P－NH2，Chart 1)表面，制得4種新型的“刷型”手性固 定 相 4a/P－NH2(簡 稱4a')，4c/P－NH2(4c')，6/P－NH2(6')和 7/P－NH2(7')。對兩種固定化方法進行了比較研究。結(jié)果表明:以縮合法制備的6'和7'的手性選擇體負(fù)載量相對較高，分別為 0.24 mmol·g－1和 0.33 mmol·g－1。以胺－酯交換法制備的 4a'和 4c'的負(fù)載量分別為 0.11 mmol·g－1和 0.10 mmol·g－1。用4－二甲基氨基吡啶(DMAP)和1－羥基苯并三唑(HOBt)為催化劑能避免4a～4c在固定化反應(yīng)中的消旋化。初步評價了6'對8種手性化合物(A～H，Chart 2)的手性識別性能。

Chart 1

Scheme 1

Scheme 2

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Varian Mercury VX－300M 型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS 為內(nèi)標(biāo));Nicolet 5DX FT－IR型紅外光譜儀(KBr壓片);Vario EL III CHNOS型元素分析儀;Alltech 1666型色譜柱填充泵;250 mm×4.6 mm不銹鋼空色譜柱;Waters型高效液相色譜儀系統(tǒng)。

2a ～2c 參照文獻［12－13］方法合成，其表征數(shù)據(jù)［14］與 Scheme 1預(yù)期結(jié)構(gòu)吻合;球形硅膠(5 μm)，青島美高化工有限公司;1a～1d，北京紅杉精化科技有限公司;HOBt和 2－乙氧基－1－乙氧碳?；?，2－二氫喹啉(EEDQ)，蘇州昊帆生物科技有限公司;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)4a～4c的合成(以4a為例)

三口燒瓶中依次加入D－苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽(2a)9.28 g(46 mmol)，二氯甲烷400 mL和三乙胺12.5 mL(90 mmol)，攪拌使其溶解;加入3 9.68 g(42 mmol)，于20 ℃反應(yīng)24 h。過濾，濾液依次用5%NaCO3溶液(3×100 mL)和飽和NaCl溶液(3×100 mL)洗滌，無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑后用二氯甲烷－正己烷重結(jié)晶兩次得4a。

用類似的方法合成4b和4c。

N－3，5－二硝基苯甲?；璂－苯甘氨酸甲酯(4a):白色絮狀固體，產(chǎn)率81%，m.p.179℃ ～7.43 ～7.44(m，5H，ArH)，5.79(d，J=7.5 Hz，1H，CH)，3.82(s，3H，CH3);IR ν:3 345(CONH)，1 736(CO2)，1 648(CONH)，1 217(C －O －C)cm－1;Anal.calcd for C16H13N3O7:C 53.49，H 3.65，N 11.70;found C 53.68，H 3.67，N 11.73。

N－3，5－二硝基苯甲?；璂－2－氯苯甘氨酸甲酯(4b):淡黃色固體，產(chǎn)率73%，m.p.133℃ ～135℃，+86.2°(c 0.4，THF);1H NMR(DMSO－d6)δ:10.05(d，J=6.3 Hz，1H，CONH)，7.45 ～9.13(m，7H，ArH)，6.10(d，J=6.0 Hz，1H，CH)，3.73(s，3H，CH3);IR ν:3 283(CONH)，1 717(CO2)，1 650(CONH)，1 234(C －O －C)cm－1;Anal.calcd for C16H12N3O7Cl:C 48.81，H 3.07，N 10.67;found C 48.86，H 3.16，N 10.54。

N－3，5－二硝基苯甲?；璂－4－硝基苯甘氨酸甲酯(4c):淡棕色固體，產(chǎn)率88%，m.p.166℃ ～168 ℃，0°(c 0.4，THF);1H NMR δ:7.59 ～9.20(m，7H，ArH)，8.33(s，1H，CONH)，5.95(d，J=6.9 Hz，1H，CH)，3.86(s，3H，CH3);IR ν:3 341(CONH)，1 744(CO2)，1 644(CONH)，1 209(C － O － C)cm－1;Anal.calcd for C16H12N4O9:C 47.53，H 2.99，N 13.86;found C 47.74，H 3.14，N 13.76。

(2)N－?；璂－苯甘氨酸(6 和 7)的合成

在三口燒瓶中加入3，5－二甲基苯甲酸53 g和二氯亞砜150 mL，攪拌下回流反應(yīng)3 h。減壓蒸餾，收集105℃/2.7 kPa餾分得無色透明液體5 54 g，產(chǎn)率 92%。

在三口燒瓶中加入1b 9.3 g(50 mmol)和2 mol·L－1NaOH溶液190 mL，攪拌使其溶解。冷卻至－2℃，緩慢滴加5 14.8 mL(100 mmol)，滴畢，于－2℃反應(yīng)24 h。過濾，濾液用乙醚(3×50 mL)萃取，收集水相，緩慢滴加6 mol·L－1鹽酸至pH 2。用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取，合并乙酸乙酯層，用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑后用乙酸乙酯－正己烷重結(jié)晶兩次得6。

用1d［8.0 g(43 mmol)］替代1b ，用 3［21.0 g(91 mmol)］替代5，用類似的方法合成粗品，經(jīng)活性碳脫色，用乙酸乙酯－正己烷重結(jié)晶得7。

6:白色晶體，產(chǎn)率54%，m.p.152℃ ～154℃，+59.0°(c 0.4，乙酸乙酯);1H NMR δ:7.13 ～ 7.49(m，7H，ArH)，6.12(d，J=7.2 Hz，1H，CH)，2.32(s，6H，CH3);IR ν:3 427(CONH，CO2H)，3 311～2 636(CO2H)，1 720(CO2H)，1 628(CONH)cm－1;Anal.calcd for C17H16NO3Cl:C 64.26，H 5.18，N 4.41;found C 64.55，H 5.06，N 4.09。

7:白色晶體，產(chǎn)率31%，m.p.219℃ ～221℃，－67.1°(c 0.4，乙酸乙酯);1H NMR(DMSO－d6)δ:13.26(s，1H，CO2H)，9.90(d，J=6.6 Hz，1H，CONH)，7.47 ～ 9.13(m，7H，ArH)，5.68(d，J=6.9 Hz，1H，CH);IR ν:3 307(NH，CO2H)，3 202～2 680(CO2H)，1 711(CO2H)，1 658(CONH)cm－1;Anal.calcd for C15H10N3O7Cl·H2O:C 45.30，H 3.04，N 10.57;found C 45.42，H 2.82，N 10.75。

1.3 苯甘氨酸衍生物的固定化

(1)4a'和 4b'的合成

在兩口瓶中依次加入4a 3.00 g(8.4 mmol)，HOBt 1.35 g(10.0 mmol)和干燥 THF 27 mL，攪拌使其溶解;加入干燥氨丙基硅膠3.22 g和催化量的DMAP，于室溫反應(yīng)48 h。離心分離，沉淀用THF洗滌，真空干燥得白色固體4a'3.35 g，增重0.13 g，負(fù)載量 0.11 mmol·g－1。濾液滴至正己烷中，析出沉淀，過濾，濾餅干燥，測得+93.7°(c 0.4，THF)。

用類似的方法合成4b'，增重0.13 g，負(fù)載量為0.10 mmol·g－1。同法測得THF)。

(2)6'和7'的合成

在兩口瓶中依次加入6 2.00 g(6.3 mmol)，EEDQ 1.71 g(6.9 mmol)和干燥 THF 7 mL，攪拌使其溶解;加入干燥氨丙基硅膠3.41 g，于室溫反應(yīng)48 h。離心分離，沉淀用THF洗滌，真空干燥得白色固體 6'3.77 g，增重 0.36 g，負(fù)載量 0.33 mmol·g－1。濾液滴至正己烷中，析出沉淀，過濾，濾餅干燥，測得+57.3°(c 0.4，乙酸乙酯)。

用類似的方法制得7'，增重0.32 g，負(fù)載量0.24 mmol·g－1。同法測得0°(c 0.4，乙酸乙酯)。

1.4 6'的對映體選擇性檢測

采用勻漿法填柱。用正己烷(30 mL)/異丙醇(95/5)勻漿，正己烷作頂替液，用填充泵在6 000 psi壓力下將6'(3.1 g)填入不銹鋼色譜柱中。以聯(lián)苯為檢測物，正己烷/異丙醇(90/10，V/V)為流動相測定柱效，用1，3，5－三叔丁基苯為樣品測得死時間。以乙醇為溶劑，將手性化合物A ～H配成1 mg·mL－1溶液，并經(jīng)0.2 μm 濾膜過濾。分別以異丙醇和乙醇與正己烷組成的混合溶液為正相流動相，以甲醇和乙腈與水組成的混合溶液為反相流動相，測試6'的對映體選擇性。在所有檢測中，流速均為1 mL·min－1，柱溫為25℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成中的消旋化

在N－?；磻?yīng)過程中，為了盡量避免產(chǎn)物的消旋化，反應(yīng)均在較低溫度下進行。實驗中發(fā)現(xiàn)，在合成4c時發(fā)生了消旋化，測得其比旋度為零。這是因為在4c的分子結(jié)構(gòu)中，硝基是強吸電子基團，其對位的芐基碳原子在三乙胺的催化下可逆地生成碳負(fù)離子，這個碳負(fù)離子能夠被酯基和苯基上的硝基所穩(wěn)定。由于碳負(fù)離子屬于sp3雜化，呈角錐形的結(jié)構(gòu)，又因為碳負(fù)離子上的一對未成對電子體積小，此構(gòu)型能自由翻轉(zhuǎn)，從而發(fā)生消旋化;或者所生成的碳負(fù)離子轉(zhuǎn)變?yōu)橄┐际降慕Y(jié)構(gòu)，也能發(fā)生消旋化。文獻［15－19］對氨基酸在堿性介質(zhì)中消旋化的現(xiàn)象進行了探討，幾乎都認(rèn)為消旋化經(jīng)歷了碳負(fù)離子的過程，本文也認(rèn)同這一觀點。

2.2 苯甘氨酸衍生物的固定化反應(yīng)

HOBt常用作酰胺鍵形成促進劑，能有效抑制產(chǎn)物消旋［20－21］。在 N－?；璂－苯甘氨酸甲酯的固定化反應(yīng)中(即4'的合成中)，不加HOBt時，反應(yīng)完成后從反應(yīng)液中回收的原料有較大程度的消旋。而使用HOBt后，從反應(yīng)混合物中回收的原料的比旋度略低于反應(yīng)前原料的比旋度。一個可能的原因是為避免因加熱帶來的消旋化，將反應(yīng)混合物滴入正己烷中，使原料沉淀出來，會有少許HOBt混雜在其中，所以比旋度稍低;另一個可能的原因就是確實發(fā)生了少量的消旋化?？偟膩碚fHOBt起到了阻止消旋化的作用。但在不同的反應(yīng)中，其阻止消旋化的機理不盡相同。

推測本反應(yīng)的機理是:4與DMAP形成的活性中間體(I)較易烯醇化，生成一對幾何異構(gòu)體II和III;當(dāng)II和III可逆地返回到I時，部分構(gòu)型發(fā)生了變化，從而產(chǎn)生消旋現(xiàn)象。在反應(yīng)體系中加入HOBt后，I與其反應(yīng)生成活性酯IV，與I相比IV不易烯醇化，IV與氨丙基硅膠(P－NH2)反應(yīng)生成V(即為固定相4')(Scheme 3)。其實，PNH2上的氨基與HOBt都能和I反應(yīng)，但HOBt溶于溶液中，與I之間的反應(yīng)是均相的，而P－NH2與I之間的反應(yīng)是異相反應(yīng)，所以HOBt和I的反應(yīng)快一些。因此，用胺－酯交換反應(yīng)固定苯甘氨酸甲酯衍生物時以DMAP和HOBt共同作為催化劑較為合適。

根據(jù)P－NH2在固定化反應(yīng)后質(zhì)量的增量計算出固定相上手性選擇體的負(fù)載量。用胺－酯交換反應(yīng)固定4a和4b制得4a'和4b'，其手性選擇體的負(fù)載量分別為 0.11 mmol·g－1和 0.10 mmol·g－1。以EEDQ為縮合劑固定6時，6'負(fù)載量達(dá)0.33 mmol·g－1，但負(fù)載量并非越高越好。

用縮合法固定選擇體時也可能發(fā)生消旋化。6和7分別從1b和1d制備，鄰位的氯和對位的氯對苯基的電子效應(yīng)沒有很大區(qū)別。但7中的苯甲?；袃蓚€強吸電子的硝基。固定化反應(yīng)是在室溫下進行的，7在P－NH2的催化下，經(jīng)過長時間的攪拌發(fā)生了消旋化。消旋化也應(yīng)經(jīng)過了形成碳負(fù)離子的過程，所形成的碳負(fù)離子得到硝基的穩(wěn)定。相反，6中的苯甲?；泻瑑蓚€甲基，甲基不能穩(wěn)定碳負(fù)離子，所以6在固定化時沒有消旋化。

Scheme 3

2.3 6'的分離性能

在正己烷/異丙醇(90/10，V/V)為流動相時測得的柱效是27 100理論塔板數(shù)/米，對稱因子為1.10。測得的死時間為3.196 min。用8種手性化合物(A～H)對6'的手性識別性能進行了初步檢測，結(jié)果見表1。從表1可見，6'有較大的分離因子(α)，即有較好的對映體選擇性。但要提高分離度，還需要進一步摸索分離條件。

Chart 2

表1 A～H在6'上的色譜分離數(shù)據(jù)Table 1 Chromatographic data of A～H resolved by 6'

從表1還可知，6'在反相中有更好的手性識別性能，在乙腈/水的流動相中尤其如此。這可能是由于甲醇為質(zhì)子溶劑，乙腈為非質(zhì)子溶劑，而非質(zhì)子溶劑與手性化合物的氫鍵作用比質(zhì)子溶劑與手性化合物的氫鍵作用小，使得手性化合物與手性選擇體之間有更好的相互作用，從而增強手性識別性能。

3 結(jié)論

合成了5個苯甘氨酸衍生物，并通過縮合反應(yīng)及胺－酯交換反應(yīng)將4種衍生物鍵合于氨丙基硅膠上，制備出4種新的“刷型”手性固定相。以胺－酯交換反應(yīng)固定N－?；璂－苯甘氨酸甲酯時，采用DMAP和HOBt為催化劑能有效避免反應(yīng)過程中苯甘氨酸衍生物的消旋化;以EEDQ為縮合劑，固定 N－?；璂－苯甘氨酸時，固定量相對較高，當(dāng)苯甘氨酸的苯甲?；嫌形娮踊鶊F時，在固定化過程中容易發(fā)生消旋化。

選擇其中一種固定化方法能制得所需要負(fù)載量的固定相。對以 N－3，5－二甲基苯甲酰基－D－2－氯苯甘氨酸為手性選擇體的固定相進行了手性識別性能評價，結(jié)果顯示這種固定相在以乙腈/水為流動相的反相模式下有較好的對映體選擇性。

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［14］D－苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽(2a):白色固體，產(chǎn)率90%，m.p.183 ℃ ～185 ℃，［α］25D+135.3°(c 0.4，CH3OH，下同);1H NMR(D2O)δ:7.47 ～7.54(m，5H，ArH)，5.29(s，1H，CH)，3.82(s，3H，CH3);IR ν:1 738(C=O)，1 242(C － O － C)cm－1.D－2－氯苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽(2b):無色晶體，產(chǎn)率87%，m.p.159 ℃ ～ 161 ℃，［α］25D+104.1°;1H NMR(D2O)δ:7.46 ～7.63(m，4H，ArH)，5.70(s，1H，CH)，3.85(s，3H，CH3);IR ν:1 756(C=O)，1 188(C －O －C)cm－1.D－4－硝基苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽(2c):淡黃色固體，產(chǎn)率70%，m.p.172 ℃ ～174 ℃，［α］25D－106.6°;1H NMR(D2O)δ:7.78 ～ 8.41(m，4H，ArH)，5.56(s，1H，CH)，3.86(s，3H，CH3);IR ν:1 744(C=O)，1 250(C－O－C)cm－1.

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