玉米胚芽油中酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇的分析方法研究

鄭淑敏，馬傳國(guó)，2*，梁少華，計(jì)曉曼

(河南工業(yè)大學(xué)1.糧油食品學(xué)院；2.小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001）

0 引言

植物甾醇具有降低血清低密度脂蛋白（LDL）的重要生理功能，還具有抗氧化、抗炎、抗癌和抗菌等功效[1-2]，但它更多是以4 種類型的衍生態(tài)存在于植物油中：甾醇脂肪酸酯（SE）、對(duì)羥基肉桂酸（對(duì)香豆酸）甾醇酯（HSE）、甾基糖苷（SG）和?；藁擒眨ˋSG），其中以SE 居多[3].游離態(tài)甾醇和酯態(tài)甾醇有不同的生理功能性質(zhì)和物理性質(zhì)，但酯態(tài)甾醇有更多的優(yōu)勢(shì)：連續(xù)8 周每天攝入9 g 甾醇酯也不會(huì)有副反應(yīng)；植物甾醇酯對(duì)降低心血管疾病效果更顯著，有研究表明，每天攝入2.5 g 植物甾醇酯是等量植物甾醇效果的2 倍[4]；酯態(tài)甾醇更易溶解在油水混合物中，它可以用作乳化劑，顯著提高分散特性[5]，還可以加入到食物中，尤其是基于潤(rùn)濕性和易于融化的飲料和牛奶產(chǎn)品，使其有更好的感官品質(zhì)并提高食品的穩(wěn)定性[6].所以將植物甾醇酯更多地保留在植物油中是現(xiàn)代精煉工藝的需求，隨之而來的甾醇酯的檢測(cè)方法也在發(fā)展之中.

國(guó)外對(duì)于甾醇酯分離分析方法有很多，最常用的有氣相色譜和高效液相法.早在1984 年，Worthington 等[7]采用薄層色譜（TLC）、氣-液色譜（GLC）聯(lián)合分析測(cè)定植物油中的甾醇酯、游離甾醇：先用制備液相色譜分離碳?xì)浠衔?、甾醇酯、游離甾醇，此時(shí)碳?xì)浠衔锱c甾醇酯一起被溶劑洗脫下來，然后利用薄層色譜把甾醇酯與碳?xì)浠衔锓珠_，甾醇酯進(jìn)行甲酯化，最后用氣-液色譜檢測(cè).Ferrari 等[8]用柱層析法進(jìn)行甾醇酯與游離甾醇的分離，最后用高效液相（HPLC）分析.Vasile 等[3]用固液萃取方法分離游離甾醇和甾醇酯，并加入一定的內(nèi)標(biāo)，氣相色譜進(jìn)行定量分析.

作者通過柱層析的方法來分離玉米胚芽毛油中游離甾醇和甾醇酯，并采用內(nèi)標(biāo)法分別計(jì)算樣品中酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇的含量，且二者的含量分別為幾種單一去甲基甾醇含量之和.主要包含3個(gè)步驟：（1）硅膠柱的制備；（2）酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇的分離；（3）通過氣相色譜方法對(duì)酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇分別進(jìn)行定量測(cè)定.

1 材料和方法

1.1 試劑與設(shè)備

玉米胚芽毛油：山東三星集團(tuán)；柱層析硅膠200～300 目、膽甾烷醇（純度≥95%）：美國(guó)sigma 公司；膽固醇硬脂酸酯（純度≥97%）：日本梯希愛公司；β-谷甾醇亞油酸酯（純度≥80%）：實(shí)驗(yàn)室合成；β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥80%）：西安藍(lán)天生物工程有限責(zé)任公司；N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）＋1%三甲基氯硅烷（TMCS）：Fluka 公司；亞油酸（≥95%）：阿拉丁化學(xué)試劑有限公司.

玻璃柱層析（內(nèi)徑1.9 cm，長(zhǎng)30 cm，配有聚四氟乙烯旋塞）；GC-7890A 氣相色譜儀、HPLC-1260 infinity 高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；RE52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品β-谷甾醇亞油酸酯的制備

1.2.1 β-谷甾醇亞油酸酯合成與分離純化

由于植物甾醇酯的標(biāo)準(zhǔn)品較難買到，且玉米胚芽毛油中甾醇酯的主要類型是β-谷甾醇亞油酸酯[9-10]，參照孟祥河等[11]的研究，采用化學(xué)法制備甾醇酯，此反應(yīng)是無溶劑體系，亞油酸同時(shí)作為反應(yīng)原料和反應(yīng)溶劑：在裝有油水分離器、溫度計(jì)、磁力攪拌子的三口燒瓶中，加入事先干燥過夜的β-谷甾醇與亞油酸（其摩爾比為2∶1），加熱到適當(dāng)溫度形成熔融體系后再加入混合催化劑（氧化鈣、氧化鎂、氧化鑭摩爾比為3∶2∶5），沖入N2，油浴加熱并攪拌，170 ℃下恒溫反應(yīng)8 h，得到β-谷甾醇亞油酸酯粗產(chǎn)品.

粗產(chǎn)品的分離純化采用硅膠柱層析分離[12]：稱取反應(yīng)混合物約5 g，溶解在5 mL 的石油醚中，裝入高度為25 cm 硅膠柱中，立即加入流動(dòng)相：V石油醚∶V乙醚∶V乙酸=90∶10∶1，收集洗脫液，用TLC 檢測(cè)產(chǎn)物，收集含有甾醇酯的試管溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到澄清、透明淡黃色的半流動(dòng)的β-谷甾醇亞油酸酯純品.

1.2.2 高效液相法測(cè)定β-谷甾醇亞油酸酯的純度

參照張麗霞等[13]的色譜條件：色譜柱ZORAX RX-SIL 4.6 mm×250 mm，5 μm，流動(dòng)相：V正己烷∶V乙酸乙酯∶V甲酸=90∶10∶0.5，進(jìn)樣量10 μL，流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD），漂移管溫度65 ℃，氣體流速是1.6 SLPM.配制濃度為1 mg/mL 的β-谷甾醇亞油酸酯溶液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后直接進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定.根據(jù)面積歸一化法得到的產(chǎn)品純度是89.68%.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米胚芽油中酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇的分析方法的前處理

玉米胚芽油中酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇的分離：參照Verleyen 等[14]的研究，利用游離甾醇和甾醇酯的極性不同將它們分離，總共分為兩步：（1）柱層析的制備：稱取15 g 硅膠溶解在50 mL 的正己烷中，進(jìn)行裝柱.（2）稱取玉米胚芽毛油1.5 g（精確至0.000 1 g）于小燒杯中，用5 mL 正己烷轉(zhuǎn)移，并加入一定量的膽固醇硬脂酸酯和膽甾烷醇標(biāo)準(zhǔn)品，裝入硅膠柱.采用梯度洗脫：加入85 mL正己烷/乙酸乙酯（體積比為90∶10），用TLC 檢測(cè)產(chǎn)物，收集酯態(tài)甾醇部分，之后立即加入85 mL 正己烷/乙醚/無水乙醇（體 積比為25∶25∶50），用TLC檢測(cè)產(chǎn)物，收集游離態(tài)甾醇，最后利用旋蒸去除溶劑，分別得到了兩種組分，即酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇.

兩種組分的皂化、提純、衍生化：酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇分別加入2 mol/L 氫氧化鉀乙醇溶液進(jìn)行皂化，用乙醚提取不皂化物，水洗至中性，旋蒸溶劑；0.4 mL 氯仿復(fù)溶點(diǎn)板，展開劑為正己烷∶乙醚（體積比為65∶35 ），刮出甾醇帶，并用乙醚萃??；加入100 μL 99% BSTFA＋1%TMCS 硅烷化試劑水浴70 ℃衍生化40 min，氮?dú)獯蹈桑? mL 正己烷定容并用無水硫酸鈉干燥，吸取上清液進(jìn)氣相（GC）分析.

1.3.2 玉米胚芽油中酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇的氣相分析

按照魏佳麗等[15]的測(cè)總甾醇含量的氣相色譜條件：色譜柱：HP-5（30.0 m×250 μm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度300 ℃；載氣：高純氮?dú)猓环至鞅龋?0∶1；柱流速：1.0 mL/min；柱溫：285 ℃（20 min）；檢測(cè)器溫度360 ℃；進(jìn)樣量1 μL.

采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算每種甾醇的含量，即加入的內(nèi)標(biāo)定量?jī)刹糠值膯蝹€(gè)甾醇含量，其中膽固醇硬脂酸酯作為酯態(tài)甾醇的內(nèi)標(biāo)，且酯態(tài)甾醇總含量為單個(gè)酯態(tài)甾醇（皂化之后變成游離態(tài)）含量之和；膽甾烷醇作為游離甾醇的內(nèi)標(biāo)，游離態(tài)甾醇總含量為單個(gè)游離態(tài)甾醇之和，總甾醇含量是兩態(tài)甾醇之和.各個(gè)單個(gè)甾醇組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表1.同時(shí)對(duì)檢測(cè)方法的重復(fù)性、加標(biāo)回收率、精密度、穩(wěn)定性進(jìn)行分析.

表1 單個(gè)甾醇組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 The standard curve of individual sterol components

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米胚芽油中酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇的分離

分析方法是基于游離甾醇和甾醇酯的極性不同.游離甾醇用非極性溶劑洗脫時(shí)在硅膠柱上保留較長(zhǎng)時(shí)間，因?yàn)橛坞x甾醇比酯態(tài)甾醇有更強(qiáng)的極性.最重要的是一個(gè)適當(dāng)?shù)娜軇┍仁菫槟馨阉械溺薮减ハ疵摮鰜矶延坞x甾醇繼續(xù)保留在硅膠柱中.第一步，用不同的非極性溶劑進(jìn)行洗脫，非極性溶劑主要為正己烷，通過添加少量的乙酸乙酯調(diào)節(jié)極性.只有當(dāng)正己烷/乙酸乙酯的體積比是90∶10 時(shí)所有的酯態(tài)甾醇在第一組分中分離下來并能和第二組分的游離態(tài)甾醇很好地分開.第二步，硅膠柱用極性溶劑保留游離甾醇，游離態(tài)甾醇在第二步洗脫時(shí)用正己烷/乙醚/無水乙醇（體積比為25∶25∶50）極性溶劑洗脫.以玉米胚芽毛油為例，所收集的二者的組分與β-谷甾醇和膽固醇硬脂酸酯標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，薄層板對(duì)照如圖1 所示.

由圖1 可知，第一組分D 主要含有甾醇酯和甘三酯，且不含游離甾醇.第二組分E 主要含有游離甾醇和少量甘三酯，且不含甾醇酯，為了驗(yàn)證游離甾醇和甾醇酯分離完全，將D 組分和E 組分分別處理后進(jìn)氣相分析，二者的氣相色譜如圖2 所示.

圖1 玉米胚芽毛油中游離甾醇和甾醇酯分離效果Fig.1 The separation effect of esterified and free sterols in the crude corn germ oil

圖2 酯態(tài)甾醇A 和游離態(tài)甾醇B 經(jīng)過皂化、提取不皂化物、衍生化后所得的GC 色譜圖Fig.2 The GC analysis of esterified sterols A and free sterols B after saponified，extracted，and derivatized

由圖2 可知：膽固醇硬脂酸酯經(jīng)過皂化處理后變成膽固醇，出峰時(shí)間在9.1 min 左右（比對(duì)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品），且完全在A 圖出峰，在B 圖沒有出峰；同樣，膽甾烷醇只在B 圖中完全出峰，沒有在A 圖出峰，因此，認(rèn)為兩態(tài)甾醇分離完全.這些數(shù)據(jù)表明了用最小溶劑在硅膠柱上用正己烷/乙酸乙酯（體積比為90∶10）和正己烷/乙醚/無水乙醇（體積比為25∶25∶50）能夠分開酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇.而且，洗脫第一組分溶劑的極性是很重要的.所以采用正己烷/乙酸乙酯體積比是90∶10 時(shí)，正己烷/乙醚/無水乙醇體積比是25∶25∶50，能實(shí)現(xiàn)玉米胚芽毛油中酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇的分離.

2.2 檢測(cè)方法的分析

2.2.1 重復(fù)率的測(cè)定

以玉米水化脫膠油作為油樣，取7 組進(jìn)行重復(fù)性測(cè)定，酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇重復(fù)性試驗(yàn)如表2和表3 所示.

從表2 和表3 可以看出，總酯態(tài)甾醇和總游離態(tài)甾醇以及單一去甲基甾醇含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.28%～2.25%之間.相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差總體不大，重復(fù)性較好.

表2 玉米水化脫膠油中酯態(tài)甾醇重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The repeatability results of esterified sterols in the degumming corn oil mg·(100 g)-1

表3 玉米水化脫膠油中游離態(tài)甾醇重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The repeatability results of free sterols in the degumming corn oil mg·(100 g)-1

2.2.2 加標(biāo)回收率的測(cè)定

加標(biāo)回收率的測(cè)定采用1.2.2 的氣相色譜法，并添加一定量的實(shí)驗(yàn)室自制β-谷甾醇亞油酸酯標(biāo)準(zhǔn)品和β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果見表4 和表5.

表4 酯態(tài)甾醇的加標(biāo)回收率Table 4 The recovery rate of esterified sterols with internal standard

表5 游離態(tài)甾醇的加標(biāo)回收率Table 5 The recovery rate of free sterols in the degumming corn oil

由表4 和表5 可知，利用柱層析方法分離玉米胚芽毛油中的酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇并用氣相色譜法測(cè)得二者的回收率分別是90.71%、94.73%，回收率較高，該方法可行.

2.2.3 精密度的測(cè)定

以玉米水化脫膠油作為油樣，測(cè)定采用1.2.2的氣相色譜法，連續(xù)測(cè)定7 次，其中單一去甲基甾醇（包含酯態(tài)和游離態(tài)）和兩態(tài)甾醇總含量的RSD見表6 和表7.

表6 玉米水化脫膠油中酯態(tài)甾醇精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The precision results of esterified sterols in the degumming corn oil mg·(100 g)-1

表7 玉米水化脫膠油中游離態(tài)甾醇精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 7 The precision results of free sterols in the degumming corn oil mg·(100 g)-1

從表6 和表7 可以看出，單一去甲基甾醇（包含酯態(tài)和游離態(tài)）以及兩態(tài)甾醇總含量的RSD 在0.72%～2.25%之間，表明該試驗(yàn)所用氣相色譜儀精密度良好.

2.2.4 穩(wěn)定性的測(cè)定

以玉米胚芽毛油為油樣，測(cè)定采用1.2.2 的氣相色譜法，連續(xù)3 d 每天重復(fù)測(cè)定3 次，來評(píng)價(jià)其日間穩(wěn)定性，其中單一去甲基甾醇（包含酯態(tài)和游離態(tài)）和兩態(tài)甾醇總含量的RSD 見表8 和表9.

從表8 和表9 可知，樣品在等待進(jìn)樣期間，濃度變化不是特別大，單一去甲基甾醇和兩態(tài)甾醇總含量的RSD 在0.63%～3.22%之間，表明該方法穩(wěn)定性良好.

3 結(jié)論

利用柱層析法能實(shí)現(xiàn)玉米胚芽毛油中酯態(tài)甾醇與游離態(tài)甾醇的分離，酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇分別用正己烷/乙酸乙酯（體積比為90∶10）和正己烷/乙醚/無水乙醇（體積比為25∶25∶50）洗脫，之后將這兩種組分分別進(jìn)行皂化、提純、衍生化并利用氣相色譜法定量，該方法中酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.32%、1.46%；并加入實(shí)驗(yàn)室自制β-谷甾醇亞油酸酯作為酯態(tài)甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，回收率分別為90.71%、94.73%；精密度試驗(yàn)中樣品連續(xù)測(cè)定7 次得到單一去甲基甾醇（包含酯態(tài)和游離態(tài)）以及兩態(tài)甾醇總含量的RSD 在0.72%～2.25%之間；穩(wěn)定性試驗(yàn)中連續(xù)3 d 每天重復(fù)測(cè)定3 次，得到樣品在等待進(jìn)樣期間，濃度變化不是特別大，單一去甲基甾醇（包含酯態(tài)和游離態(tài)）和兩態(tài)甾醇總含量的RSD 在0.63%～3.22%之間，總之該方法精密度高、穩(wěn)定性好，能用于玉米胚芽油中酯態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇的分離以及含量的測(cè)定.

表8 玉米胚芽毛油中酯態(tài)甾醇穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 8 The stability results of the esterified sterols in the crude corn germ oil mg·(100 g)-1

表9 玉米胚芽毛油中游離態(tài)甾醇穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 9 The stability results of the free sterols in the crude corn germ oil mg·(100 g)-1

［1］韓軍花.植物甾醇的性質(zhì)、功能及應(yīng)用［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2001，28（5）:285-291.

［2］Ntanios F Y，Van De Kooij A J，De Deckere E A，et al.Effects of various amounts of dietary plant sterol esters on plasma and hepatic sterol concentration and aortic foam cell formation of cholesterolfed hamsters［J］.Atherosclerosis，2003，169（1）:41-50.

［3］Dulf F V，Unguresan M L，Vodnar D C，et al.Free and esterified sterol distribution in four Romanian vegetable oil［J］.Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca，2010，38（2）:91-97.

［4］Moreau R A，Whitaker B D，Hicks K B.Phytosterols，phytostanols，and their conjugates in foods:structural diversity，quantitative analysis，and health -promoting uses［J］.Progress in Lipid Research，2002，41（6）:457-500.

［5］Phillips K M，Ruggio D M，Toivo J I，et al.Free and esterified sterol composition of edible oils and fats［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2002，15（2）:123-142.

［6］Peter Horlacher，Dieter Hietsch，Wolfgang，et al.Sterol esters having short-chained fatty acids：DE，WO2007101580 A2［P］.2007-09-13.

［7］Worthington R，Hitchcock H.A method for the separation of seed oil steryl esters and free sterols:application to peanut and corn oils［J］.Journal of the American Oil Chemists Society，1984，61（6）:1085-1088.

［8］Ferrari R A，Esteves W，Mukherjee K D，et al.Alteration of sterols and steryl esters in vegetable oils during industrial refining［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45（12）:4753-4757.

［9］Esche R，Scholz B，Engel K H.Analysis of free phytosterols/stanols and their intact fatty acid and phenolic acid esters in various corn cultivars ［J］.Journal of Cereal Science，2013，58（2）:333-340.

［10］Esche R，Barnsteiner A，Scholz B，et al.Simultaneous analysis of free phytosterols/phytostanols and intact phytosteryl/phytostanyl fatty acid and phenolic acid esters in cereals［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（21）:5330-5339.

［11］孟祥河，潘秋月，邵平，等.一種植物甾醇酯的制備方法:中國(guó)，101235067A［P］.2008-08-06.

［12］Qianchun D，Pin Z，Qingde H，et al.Chemical synthesis of phytosterol esters of polyunsaturated fatty acids with ideal oxidative stability［J］.European Journal of Lipid Science and Technology，2011，113（4）:441-449.

［13］張麗霞，畢艷蘭，張康逸.植物甾醇與甾醇酯的分離分析方法研究［J］.糧油加工與食品機(jī)械，2006（2）:53-55.

［14］Verleyen T，Sosinska U，Ioannidou S，et al.Influence of the vegetable oil refining process on free and esterified sterols［J］.Journal of the American Oil Chemists’Society，2002，79（10）:947-953.

［15］魏佳麗，馬傳國(guó)，柴小超，等.米糠毛油中去甲基甾醇檢測(cè)方法的對(duì)比研究［J］.中國(guó)油脂，2014，39（1）:61-64.