新型大豆苷元-8-胺甲基化衍生物的合成研究

尹秋月，袁金偉，薛 穎，肖詠梅，毛 璞，屈凌波

（河南工業(yè)大學 化學化工學院，河南 鄭州 450001）

0 引言

大豆苷元（7,4′ -二羥基異黃酮，daidzein）的相對分子質(zhì)量為254，白色粉末狀固體，在水中溶解度極?。?.445 μg/mL），化學結構見圖1.大豆苷元主要存在于豆科植物如大豆中，是一種重要的異黃酮化合物，具有抗氧化[1]、保護心血管[2-3]、抗癌[4]、調(diào)節(jié)雌激素[5]和治療骨質(zhì)疏松[6]等廣泛的藥理活性，在食品、保健品、藥品和化妝品等領域得到廣泛的應用.但是，大豆苷元由苯環(huán)A 和B 通過中間的環(huán)C 連接而成的一個共軛體系，空間結構幾乎成為一個平面，剛性結構強，即使大豆苷元結構中含有2 個羥基，由于分子間形成氫鍵等因素的影響，其親水性和親脂性都較差，從而導致其生物利用度低，限制了其在臨床上的使用[7].因此，通過對大豆苷元的結構進行修飾，改變其物化性質(zhì)或引入活性基團，提高其生物利用度已成為當前研究的熱點.

圖1 大豆苷元的化學結構Fig.1 Chemical structure of daidzein

近年來，為了改善大豆苷元的溶解性，進一步提高大豆苷元的生物活性，一系列的大豆苷元衍生物已經(jīng)被合成.如張尊聽等[8-9]利用磺化反應合成出系列的大豆苷元的磺酸鹽，提高了其在水中的溶解度，抗氧化和缺血活性也有明顯的提高.陳曉嵐等[10-11]利用磷酰化反應合成出一系列的大豆苷元磷?；苌铮ζ渑c蛋白的弱相互作用及Cease 和AChE 抑制作用進行了研究.屈凌波等[12-13]以大豆苷元、甲醛為原料，在脂肪胺催化下合成出大豆苷元雙黃酮衍生物，并對反應條件進行了優(yōu)化.Strong 等[14]設計并合成系列烷基化等大豆苷元衍生物，對成骨細胞的成長具有較好的作用.但是，對于大豆苷元的胺甲基化衍生物的合成，還未見文獻報道.N—烷基官能團插入分子中往往比母體化合物的溶解度有顯著的提高，且提高了藥物的活性，降低了毒副作用[15].Mannich 胺甲基化反應是形成C—N 鍵，在化合物中引入N—烷基官能團的一個有效的反應.因此，作者以大豆苷元為原料，分別與甲醛和不同的一級胺或二級胺發(fā)生Mannich 反應，設計并合成了6 個大豆苷元胺甲基化衍生物，見圖2，其結構通過IR、1H NMR、13C NMR和HR MS 進行了確認，并對反應溶劑、溫度、時間和反應物的物質(zhì)的量比等影響因素進行了考察.

圖2 大豆苷元-8-胺甲基化衍生物的合成Fig.2 Synthesis of daidzein-8-aminomethylated derivatives

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆苷元（98%）：陜西慧科植物開發(fā)有限公司；37%甲醛水溶液、異丙胺、正丙胺、正丁胺、二甲胺、二乙胺和二正丙基胺均為分析純：阿拉丁試劑公司；甲醇、乙醇、異丙醇、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、氯仿等溶劑均為分析純：國藥集團試劑有限公司.

1.2 儀器與設備

Bruker 400 MHz 超導核磁共振儀（DMSO-d6為溶劑，TMS 為內(nèi)標）：瑞士Bruker 公司；Agilent LCMSD-Trap-XCT 高分辨質(zhì)譜儀（CH3OH 為溶劑）：美國Agilent 公司；Shimadazuir-408 型紅外光譜儀（KBr 壓片）：日本島津公司；XT-4 型顯微熔點儀（溫度未校正）：北京泰克儀器有限公司.

1.3 大豆苷元-8-胺甲基化衍生物的合成

稱取1.0 g（3.9 mmol）大豆苷元于50 mL 圓底燒瓶中，加入10 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，在室溫下攪拌至溶液澄清.然后向溶液中加入0.5 mL 37 %的甲醛水溶液，攪拌均勻后再加入1.2 g（3.9 mmol）正丙胺.65 ℃通過TLC 跟 蹤監(jiān)測，反應進行4～6 h 后停止.減壓蒸除溶劑后，反應液靜置后析出固體.用無水乙醇重結晶或通過快速柱層析(=8∶1)分離，得到純品7，4′-二羥基-8-異丙胺甲基-異黃酮.

其他目標化合物的合成同上.

1.4 目標化合物的表征

7,4′ -二羥基-8-異丙胺甲基-異黃酮：白色粉末，熔點：131～132 ℃.IR (KBr) ν(cm-1)：3 438(—NH，—OH)，3 084，2 963，2 851(—CH3，—CH2)，1 681 (C＝O)，1 280 (C—N)；1H NMR(DMSO-d6)δ：1.16 (d，J=6.4 Hz，6H，—NHCH (CH3)2)，3.03 (m，1H，—NHCH(CH3)2)，4.17 (s，2H，C8—CH2)，6.63(d，J=8.9 Hz，1H)，6.80 (d，J=8.6 Hz，2H)，7.36(d，J=8.6 Hz,2H)，7.78(d，J=8.9 Hz，1H)，8.21(s，1H)；13C NMR (DMSO -d6)δ：24.0，43.8，53.0，109.8，110.2，112.2，116.2，122.7，125.0，127.6，130.1，153.0，155.4，157.5，161.4，175.2 (C＝O)；HR MS m/z：326.139 1[M+H]+(calculated for C19H20NO4+326.138 7).

7，4′ -二羥基-8-正丙胺甲基-異黃酮：白色粉末，熔點：137～138 ℃.IR (KBr) ν(cm-1):3 445(—NH，—OH)，3 088，2 965，2 854(—CH3，—CH2)，1 683 (C ＝O)，1281 (C—N)；1H NMR(DMSO-d6) δ:0.95 (t，J=7.4 Hz，3H，—NHCH2CH2CH3)，1.57 (m，2H)，2.71 (m，2H)，4.05 (s，2H，C8—CH2)，6.67 (d，J=8.8 Hz，1H)，6.80(d，J=8.6 Hz，2H)，7.37(d，J=8.6 Hz，2H)，7.80(d，J=8.8 Hz，1H)，8.19(s，1H);13C NMR (DMSO-d6)δ:11.7(—NHCH2CH2CH3)，20.8，48.6，56.4，109.8，115.3，116.2，117.8，122.9，123.7，126.3，130.5，152.7，155.6，157.4，169.6，175.2(C ＝O)；HR MS m/z：326.138 8 [M+H]+(calculated for C19H20NO4+326.138 7).

7，4′ -二羥基-8-正丁胺甲基-異黃酮：白色粉 末，熔 點：140～141 ℃.IR (KBr) ν(cm-1):3 485(—NH，—OH)，3 020，2 833(—CH3，—CH2)，1687(C＝O)，1274(C—N)；1H NMR (DMSO-d6) δ:0.88 (t，J=7.2 Hz，3H，—NHCH2CH2CH2CH3)，1.34(m，2H)，1.51 (m，2H)，2.70(t，J=7.2 Hz，2H)，4.15(s，2H)，6.67 (d，J=8.8 Hz，1H)，6.80(d，J=8.6 Hz，2H)，7.37 (d，J=8.6 Hz，2H)，7.81 (d，J=8.8 Hz，1H)，8.21 (s，1H)；13C NMR (DMSO -d6) δ:13.9 (—NHCH2CH2CH2CH3)，21.9，32.8，48.7，55.2，109.7，115.3，116.2，117.7，122.9，123.7，126.3，130.5，152.7，155.6，157.4，169.5，175.2(C＝O)；HR MS m/z：340.154 6[M+H]+(calculated for C20H22NO4+340.154 3).

7，4′ -二羥基-8-二甲胺甲基-異黃酮：白色粉末，熔點：124～125 ℃.IR (KBr) ν(cm-1):3 440(—OH)，2 955，2 853(—CH3，—CH2)，1 624(C＝O)，1 265 (C—N)；1H NMR (DMSO-d6)δ:2.80(s，6H)，4.42 (s，2H)，6.84 (d，J=8.7 Hz，2H)，7.24 (d，J=8.9 Hz，1H)，7.38 (d，J=8.7 Hz，2H)，8.08 (d，J=8.9 Hz，1H)，8.32 (s，1H)，9.66 (s，1H)，11.94 (bs，1H)；13C NMR (DMSO-d6) δ:43.0，49.0，104.5，114.9，115.5，117.0，122.6，124.1，129.0，130.5，153.0，156.6，157.8，162.4，175.2(C＝O)；HR MS m/z：312.123 2[M+H]+(calculated for C18H18NO4+312.123 0).

7，4′ -二羥基-8-二乙胺甲基-異黃酮：白色粉末，熔點：135～136 ℃.IR (KBr) ν(cm-1):3 439(—OH)，3 085，2 962，2 852 (—CH3，—CH2)，1 680(C＝O)，1 280 (C—N)；1H NMR (DMSO-d6) δ:1.34(t，J=6.9 Hz，6H，—N (CH2CH3)2)，3.16 (q，J=6.9 Hz，4H)，4.39(s，2H)，6.89(d，J=8.6 Hz，2H)，7.28(d，J=8.9 Hz，1H)，7.39 (d，J=8.6 Hz，2H)，8.06 (d，J=8.9 Hz，1H)，9.70(s，1H)，8.38(s，1H)，12.02(s，1H)；13C NMR (DMSO -d6)δ:9.02，44.0，47.7，104.7，114.9，115.4，115.5，117.0，122.6，124.0，128.8，130.4，153.1，156.6，157.8，162.4，175.2 (C=O)；HR MS m/z：340.154 5[M+H]+(calculated for C20H22NO4+340.154 3).

7，4′ -二羥基-8-二正丙胺甲基-異黃酮：白色粉末，熔點：145～146 ℃.IR (KBr) ν(cm-1):3 445(—OH)，3 085，2 962，2 852 (—CH3，—CH2)，1 675(C＝O)，1 270(C—N)；1H NMR(DMSO-d6)，δ:0.86(t，J=7.3 Hz，6H，—N(CH2CH2CH3)2)，1.55(m，4H)，2.54(m，4H)，4.07 (s，2H)，6.82 (m，3H)，7.39 (d，J=8.6 Hz，2H)，7.89 (d，J=8.8 Hz，1H)，8.29 (s，1H)；13C NMR (DMSO-d6)δ:12.0 (—N(CH2CH2CH3)2)，19.3，50.4，55.4，108.7，115.4，115.7，116.4，123.0，123.7，126.0，130.5，152.8，155.3，157.6，164.5，175.2 (C＝O)；HR MS m/z：368.185 4 [M+H]+(calculated for C22H26NO4+368.185 6).

2 結果與分析

2.1 反應位點的確證

大豆苷元-8-胺甲基化衍生物的IR 圖譜上，3 440 cm-1左右是—OH 的吸收峰，3 085～2 833 cm-1的吸收峰為—CH3和—CH2中的C—H 振動吸收峰，1 650 cm-1左右是C＝O 的吸收峰，1 265～1 280 cm-1的吸收峰為C—N 振動吸收峰，證實了大豆苷元-8-胺甲基化衍生物的形成.當以大豆苷元為原料發(fā)生Mannich 反應時，大豆苷元的芳環(huán)上有多個反應位點，但是通過控制反應條件，該反應區(qū)域選擇性的在大豆苷元的8 位發(fā)生反應，形成了一系列大豆苷元-8-胺甲基化衍生物.如目標化合物8-二正丙胺甲基大豆苷元衍生物（7，4′ -二羥基-8-二正丙胺甲基-異黃酮），根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)可知，有368 [M+H]+的分子離子峰，說明生成的是單胺甲基大豆苷元衍生物.在大豆苷元的1H NMR 譜上，δ 6.88 (s，1H)是A 環(huán)上H-8 的化學位移，而在8-二正丙胺甲基大豆苷元衍生物的1H NMR 譜上H-8 的峰消失，且在δ 4.07 (s，2H)處出現(xiàn)了一個亞甲基的峰.在13C NMR 譜中，大豆苷元A 環(huán)上C-8 的化學位移是δ 102.5，而8-二正丙胺甲基大豆苷元衍生物上C-8 的化學位向低場移動6.2 ppm 至δ 108.7，而其相鄰碳的化學位移變化不大.通過1H NMR，13C NMR 和質(zhì)譜數(shù)據(jù)綜合分析，雖然大豆苷元發(fā)生胺甲基化反應的位點有多處，但在此反應中的反應位點是8 位，該反應具有明顯的區(qū)域選擇性.

2.2 大豆苷元-8-胺甲基化衍生物合成的影響因素研究

為了提高目標化合物的產(chǎn)率，以大豆苷元、甲醛和二正丙基胺為反應底物，對溶劑、時間、溫度和反應物的物質(zhì)的量比等因素進行了考察.

2.2.1 反應溶劑的影響

由于大豆苷元溶解度較差，反應溶劑的選擇將對于產(chǎn)物的產(chǎn)率有較大的影響.根據(jù)黃酮類化合物的溶解性能，分別選擇甲醇、乙醇、異丙醇、THF和DMF 等為溶劑，反應物大豆苷元與二正丙基胺的物質(zhì)的量比為1∶1，反應時間為6 h，反應溫度為65 ℃，結果如圖3 所示.結果表明：以甲醇、乙醇和四氫呋喃為溶劑時，由于大豆苷元在其中的溶解性差，因此產(chǎn)率較低（<30.0%）；改用異丙醇為溶劑時，產(chǎn)率有所提高（42.0%）；當以DMF 為溶劑時，產(chǎn)率明顯提高（58.0%），且副產(chǎn)物較少，易于分離，因此選用DMF 為反應溶劑.

圖3 反應溶劑對產(chǎn)率的影響Fig.3 The influence of the solvent on the yield

2.2.2 反應溫度的影響

以DMF 為反應溶劑，選擇0、20、40、65、80、100 ℃不同的反應溫度，反應物的物質(zhì)的量比為1∶1，反應時間為6 h，結果如圖4 所示.結果表明：反應溫度對該反應具有明顯的影響.隨著溫度的升高反應產(chǎn)率逐步增加，當溫度為65 ℃時產(chǎn)率達到最高值84%；繼續(xù)升高溫度，目標產(chǎn)物的產(chǎn)率反而下降.分析其中的原因，可能是在65 ℃以下，該反應受到熱力學規(guī)律控制，升高溫度，增加了分子的動能，反應的速度增加，產(chǎn)物的產(chǎn)率隨之提高；當溫度超過65 ℃以后，由于大豆苷元結構中的酚羥基容易氧化，或有雙胺甲基化產(chǎn)物等副產(chǎn)物生成，因而會導致產(chǎn)物的產(chǎn)率降低.因此，該反應選擇65 ℃為最佳的反應溫度.

圖4 反應溫度對產(chǎn)率的影響Fig.4 The influence of the temperature on the yield

2.2.3 反應時間的影響

以大豆苷元與二正丙基胺(物質(zhì)的量比為1∶1)為原料，DMF 為反應溶劑，選擇0.5、2.0、4.0、6.0、8.0 h 不同的時間在65 ℃溫度下反應，結果如圖5所示.結果顯示：在2.0 h 之前，反應產(chǎn)率增加明顯；在2.0 h 后，隨反應時間延長反應產(chǎn)率緩慢增加；反應6.0 h 時，產(chǎn)率達到最高（84.0%）；如果繼續(xù)延長反應時間，目標產(chǎn)物的產(chǎn)率開始下降，原因可能是部分單取代的胺甲基化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為雙取代的大豆苷元衍生物，從而使目標產(chǎn)物的產(chǎn)率降低.因此選擇6.0 h 為最佳的反應時間.

圖5 反應時間對產(chǎn)率的影響Fig.5 The influence of the time on the yield

2.2.4 反應物的物質(zhì)的量比對反應的影響

以DMF 為溶劑，大豆苷元與二正丙胺的物質(zhì)的量比 分別選 擇為2.5∶1，2∶1，1.5∶1，1∶1 和0.5∶1，在65 ℃下反應6.0 h.由于甲醛采用的是37%的甲醛水溶液，在反應過程中部分會揮發(fā)，因此反應中甲醛的量都是過量的（是大豆苷元的3 倍），結果如圖6 所示.結果表明：反應原料的物質(zhì)的量的比對產(chǎn)率有明顯的影響，隨著二正丙胺量的增加，產(chǎn)物的產(chǎn)率逐漸升高；當其物質(zhì)的量比為1∶1 時，反應產(chǎn)率達到84.0%；繼續(xù)增加二正丙胺的量，產(chǎn)物的產(chǎn)率反而下降，原因可能是由于反應液中胺過量，隨著時間的延長，生成的大豆苷元的單胺甲基化取代產(chǎn)物部分轉(zhuǎn)化成雙取代的產(chǎn)物，從而導致單取代產(chǎn)物的產(chǎn)率降低.因此，大豆苷元與二正丙胺最佳的物質(zhì)的量比為1∶1.

以大豆苷元、甲醛和二正丙胺為原料，通過對反應的考察，篩選出最佳的反應條件，即大豆苷元與胺的物質(zhì)的量比為1∶1，在65 ℃DMF 溶劑中反應6 h，最高產(chǎn)率可達84.0%.

圖6 反應物的物質(zhì)的量的比對產(chǎn)率的影響Fig.6 The influence of the molar ratio of reactants on the yield

3 結論

以大豆苷元、甲醛和一級胺或二級胺為原料，通過Mannich 反應成功合成了一系列大豆苷元-8-胺甲基化衍生物，該反應具有明顯的區(qū)域選擇性，通過IR、1H NMR、13C NMR 和HR MS 對產(chǎn)物的結構進行了確認.對反應物的比例、溶劑、溫度和時間等影響因素進行了優(yōu)化，得到最佳的反應條件，該方法為大豆苷元的選擇性胺甲基化衍生物的合成提供了一條方便可行的路線.

［1］曾靖，黃志華，邱峰，等.大豆苷元耐缺氧的實驗研究［J］.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2004，21（6）:454-456.

［2］范禮理，趙德化，趙敏崎，等.葛根黃酮抗心率失常作用［J］.藥學學報，1985，20（9）:647-665.

［3］Wu S Y，Brewer M S.Soy protein isolate antioxidant effect on lipid peroxidation of grouond beef and microsomal lipids［J］.J Food Sci，1994，59（4）:702-706.

［4］Colditz G A，Stampfer M J，Willett W C，et al.Type of postmenopausal hormone use and risk of breast cancer：12-year follow-up from the nurses' health study［J］.Cancer Causes Control，1992，3（5）:433-439.

［5］李潮，薛曉鷗，師莉莉.大豆苷元對去卵巢大鼠子宮雌激素受體亞型表達的影響［J］.中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2005，6（4）:269-271.

［6］Yadav D K，Gautam A K，Kureel J，et al.Synthetic analogs of daidzein，having more potent osteoblast stimulating effect［J］.Bioorg Med Chem Lett，2011，21（2）:677-681.

［7］彭游，鄧澤元，葉志剛.大豆苷元的前藥修飾研究進展［J］.化學通報，2011，74（6）:508-512.

［8］劉謙光，張尊聽，薛東.大豆苷元磺化物的合成、晶體結構及活性研究［J］.高等學?；瘜W學報，2003，24（5）:820-825.

［9］王秋亞，張尊聽.單甲基化及雙乙基化大豆苷元磺酸錳的合成及晶體結構［J］.光譜實驗室，2009，26（2）:395-402.

［10］Chen X L，Shi X N，Qu L B，et al.Synthesis of novel phosphorylated daidzein derivatives and ESI investigation on their non -covalent complexes with lysozyme［J］.Chin J Chem，2007，25（7）:1008-1013.

［11］Wei Y L，Peng A Y，Wang B，et al.Synthesis and biological evaluation of phosphorylated flavonoids as potent and selective inhibitors of cholesterol esterase［J］.Eur J Med Chem，2014，74:751-758.

［12］朱曉亮，袁金偉，肖詠梅，等.大豆苷元雙黃酮的合成研究［J］.河南工業(yè)大學學報：自然科學版，2013，34（2）:67-71.

［13］Xiao Y M，Zhu X L，Yuan J W，et al.Synthesis and characterization of novel unnatural di（8-daidzeinyl）methane ［J］.Chem Nut Compd，2014，50（1）:76-79.

［14］Strong A L，Jiang Q，Zhang Q，et al.Design，synthesis，and osteogenic actibity of daidzein analogs on human mesenchymal stem cells［J］.ACS Med Chem Lett，2014（5）:143-148.

［15］Hari Babu T，Rama Subba Rao V，Tiwari A K，et al.Synthesis and biological evaluation of novel 8-aminomethylated oroxylin A analogues as α -glucosidase inhibitors［J］.Bioorg Med Chem Lett，2008，18（5）:1659-1662.